2010实验五六 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15％的无菌甘油或—70℃保存有效期6个月。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用
CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现 转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那
霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，
则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
提高转化效率的几个因素
➢ 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯 水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处
➢ 防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
但制备较复杂，不适合实验室用
➢ 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需
电击仪
➢ CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用
时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下
保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
CaCl 2 法制备感受态细胞原理
物 学
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
四. 问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细 胞？各有什么优缺点？
2
20008
1
0
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告范文
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
感受态的制备与抗药性筛选
筛选阳性克隆的策略
转化后→平板筛选1→克隆扩增,提质粒→ →PCR 鉴定→质粒双酶切鉴定2→重组质粒序列分析 3→重组蛋白鉴定4
筛选阳性克隆的方法
1. 平板筛选：针对遗传表型改变的筛选方法 插入失活双抗生素对照筛选 插入表达筛选 -半乳糖苷酶系统筛选（-互补）
（-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深 蓝沉淀）
充分弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300l，重悬菌体，冰浴30min
40C，5000rpm×10min 弃上清，将管倒置于滤纸上1min （沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 120l，重
悬菌体，加入9 L DMSO，混匀 -80℃保存)
每管加入质粒5 l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置15min 试管放入预加温至42℃的循环水中，放置90s，不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min
感受态：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的 状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞
制备感受态细胞和转化的常用方法
CaC l2转化法：传统方法；转化效率能达到 5106~2107转化子/g质粒DNA；简单、快速、重复 性好；菌株适用范围广。
CaCl2 /MnCl2法： 能提高转化的效率，但是降低了菌 株的适用范围，主要用于DH1、DH5、MM294等。
在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复 合物能粘附于细菌表面，经过42℃短时间热冲击处理， 促进感受态细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生 长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基 因在转化细菌中得到表达，在选择性培养基平板上即 可筛选出所需的转化子。
重组DNA转化及筛选实验操作
取出试管后，每管加入LB培养基800l， 置于37℃摇床（100~150r/min），温和震荡45min 将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面 室温放置20min，正置平板使液体被吸收 倒置平皿，37℃培养，12小时可见菌落生长
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DN A分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12 X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
研究生实验五 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选共30页
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
研究生实验五 大肠杆菌感受态的制备、 重组DNA的转化和抗药性筛选
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
专业技能训练（分子生物学部分）实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E. coli JM 109菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
(整理)DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA重组DNA重组（基因重组）是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。
原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。
受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。
通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。
自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。
高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。
基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。
基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA 分子连接，得到重组DNA，并将其导入到受体中（微生物或高等动植物），从而使受体获得某些有益性状。
1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。
此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。
质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
YAC、BAC、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA技术中常用的载体。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
【VIP专享】大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上清，用剩余的100μl上清重悬菌体，涂布于含Amp的筛选平板上（已涂布IPTG 7µl和X-Gal 40 µl），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
附录： LB液体培养基：胰蛋白胨1％ 酵母提取物0.5％ NaCl 1％ 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
【注意事项】
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 细胞生长状态和密度：最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和重组子筛选
•大肠杆菌处于00C,CaCl2低渗溶 液中,菌细胞膨胀成球形, •外源DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面, •经短时间420C热击处理,促进细 胞吸收DNA复合物。然后将冰水 孵育后的细菌置于非选择性培养 基上震荡培养。 •再转到含氨苄青霉素的选择性 培养基上，长出来的菌即为转入 了外源基因的菌株。同时，也可 进行蓝白斑筛选。
感受态细胞100ul用纯水代替质粒?冰浴10分钟?426090秒静置勿摇动?迅速放到冰上冰浴2分钟?加入900ullb培养基标明组号37200rpm摇床培养45分钟实验流程质粒转化与筛选?含ap的lb固体培养基50mgl的ap倒平板每组2个凝固后涂布40?lxgal20mgml和7?liptg200mgml
实验流程（质粒转化与筛选）
含Ap的LB固体培养基(50 mg/L的 Ap)倒平板, 每 组2个，凝固后涂布40 µL X-GAL（20 mg/mL） 和 7 µL IPTG（ 200mg/mL ）。 涂布 样品(转化培养后的菌液100uL),涂布于1号平板。 阴性对照100uL ：涂布于2号平板。 倒置平板37 ℃ 培养过夜
实验原理
X-GAL
蓝色
实验原理
IPTG
实验原理
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破 坏读码框，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列 的宿主细胞。这样，lacZ基因在宿主细胞与质粒之间实现了互 补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。 当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地 导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌 形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
研究生实验五 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选
1 目的基因的获取
1.1 化学合成法：已知序列 1.2 基因组DNA： 将某种生物的基因组DNA切割成一
定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行 克隆。这些存在于所有重组等 反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用
(2)免疫学方法：
如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白 质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。
抗 药直 性接 标选 记择 选法 择
( )
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
α 互 补 的 检 测
未转化的菌不具有抗 性，不生长； 转化了空载体，即未 重组质粒的菌，长成 蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌， 即目的重组菌，长成 白色菌落。
3 实 验 步 骤
弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净
制备受态细菌
沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 μ l，重悬菌体。 取感受态细菌100 l转移到一无菌的1.5 ml的EP管中 每管加入质粒5 l 轻轻旋转EP管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动EP管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出EP管，每管加入LB培养基400 l 置于370C摇床（100~150 rpm），温和震荡30min
3 外源基因与载体的连接
①粘性末端连接： GGATCC CCTAGG
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
等反应合成双链cDNA cDNA分子分别插入载体形成重组 等反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组 再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA cDNA的集 子，再导入宿主细胞克隆扩增。这
1 目的基因的获取
1.1 化学合成法：已知序列 化学合成
一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞， 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合， DNA片段的集合 行克隆。这些存在于所有重组库，它包含了该生物的所有基因。用于研究基因 在基因组中的情况。 在基因组中的情况。
重组DNA技术 又名基因工程 技术(又名基因工程 重组 技术 又名基因工程) (recombinant DNA technology )
定义： 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组 DNA技术，又称基因工程。 技术， 技术 又称基因工程。 广义的基因工程指按人们意愿设计， 广义的基因工程指按人们意愿设计，通过改造基因或基 因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源 技术， 因组而改变生物的遗传特性。如用重组 技术 基因转入大肠杆菌中表达， 基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的 产品；将外源基因转入动物， 产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因 动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。 动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
含pUC119-u6的白色 pUC119-u6的白色 菌落
混合有氨苄青霉素的平板
基因克隆基本步骤
分离目的基因）： ）：从生物体复杂的基因组中分离出 （1）分（分离目的基因）：从生物体复杂的基因组中分离出 所需要的DNA片段，即目的基因 所需要的DNA片段， DNA片段 切割目的基因和基因载体）： ）：用限制性内切核酸酶 （2）切（切割目的基因和基因载体）：用限制性内切核酸酶 切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 连接目的基因和基因载体）： ）：在体外将目的基因连 （3）接（连接目的基因和基因载体）：在体外将目的基因连 接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（ 接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（重组 DNA分子上 DNA 体）。
3 外源基因与载体的连接
粘性末端连接： ①粘性末端连接： GGATCC CCTAGG 平头末端连接： ②平头末端连接： GTCGAC CAGCTG
③同聚寡核苷酸末端连接 AAAGAC GTC + CTG CAGTTT ④人工接头分子连接： 人工接头分子连接： GGATCC CCTAGG
四 重组DNA导入宿主细胞
DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid) (plasmid)， DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid)，噬菌体载体 克隆常用的载体有
(phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体 (phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体 (cosimid) DNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC) (phagemid)及酵母人工染色体 (ssDNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC) 等。
大肠杆菌感受态的制备、 大肠杆菌感受态的制备、 重组DNA DNA的转化和抗药性筛选 重组DNA的转化和抗药性筛选
朱文博 中山医学院
基因克隆(又名分子克隆， 克隆) 基因克隆 又名分子克隆，DNA克隆 又名分子克隆 克隆 (gene cloning)
通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、 体外重组技术 DNA经切割 插入适当载体，并导入受体细胞， 插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。 子代分子的过程。 基因克隆的核心----体外重组(Recombination) 基因克隆的核心----体外重组(Recombination) : ----体外重组 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 DNA插入一个载体的过程 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。
转化(transformation)或转染 或转染(transfection)：通 ①转化 或转染
过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等 过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等)导入原核 DNA 或真核细胞，引起遗传性状变化的现象。 或真核细胞，引起遗传性状变化的现象。
②感染(infection)：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染， 感染 ：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染，
2 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低， DNA分子的摄取能力很低 1. 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成 当细菌处于冰冷 冰冷（ 05低渗溶液中 功 。 当细菌处于 冰冷 （ 0℃ ） 0.05-0.1M 的 CaCl2 低渗溶液 中 ， 菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加， DNA的摄取 菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取 能力增强，转化效率提高（感受态细菌） 能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。 在转化体系中形成DNA DNA- DNase的羟基 的羟基－ 2. 在转化体系中形成 DNA- 抗 DNase 的羟基 － 磷酸钙复合物能 粘附于细菌表面， 经过42 短时间热休克（ 42℃ shock） 粘附于细菌表面 ， 经过 42℃ 短时间热休克 （ heat shock ） 处 细胞膜的液晶结构发生扰动， 理 ， 细胞膜的液晶结构发生扰动 ， 出现间隙促进感受态细胞 吸收DNA复合物。 DNA复合物 吸收DNA复合物。 丰富培养基上生长1 小时后 球状细胞复原并分裂增殖， 3. 在 丰富培养基上生长 1 小时 后 ， 球状细胞复原并分裂增殖 ， 重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养 culture)平板上即可筛选出所需的转化子 平板上即可筛选出所需的转化子。 (selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。
基因克隆示意图
分、切
载载DNA (限限限限限限限限) 限
＋
目目目 目
接
宿宿宿宿
＋
重重 载
转
已 已 已 目 宿宿 宿 宿
繁繁
筛
阳 限 阳 阳阳
表表
大肠)
宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态， 宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感 DNA的状态 受态的细胞称为感受态细胞. 受态的细胞称为感受态细胞.
1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5×106转化程序法：传统方法,转化效率能达到5
2×107转化子/µg质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范 转化子/ 质粒DNA,简单、快速、重复性好、 DNA,简单 围广。 围广。
2、电穿孔转化法； 电穿孔转化法； 脂质体(liposome) (liposome)法 3、脂质体(liposome)法； 胞核的显微注射法(microinjection) (microinjection)； 4、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染； 5、磷酸钙介导的转染； 聚乙二醇介导的原生质体转化法。 6、聚乙二醇介导的原生质体转化法。
1.1 制备感受态细胞的原理
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障， 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障， 对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化 对外源分子选择性接受。 条件使细胞通透性增大，处于感受态。 条件使细胞通透性增大，处于感受态。
1.2 制备感受态细胞和转化的常用方法
（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染） 转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染） ）：将重组体引入 到宿主细胞（受体细胞） 到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行扩增繁殖， 转化后的细胞进行扩增繁殖， 获得大量的细胞繁殖群体。 （5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中 筛选阳性细胞克隆）： ）：从大量的细胞繁殖群体中 筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。 筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。
3 实 验 步 骤
弃上清，将管倒置于滤纸上 弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净 ， 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 µ l，重悬菌体。 沉淀中加入冰冷的 ，重悬菌体。 取感受态细菌100µl转移到一无菌的 µ 转移到一无菌的 转移到一无菌的1.5ml的EP管中 取感受态细菌 的 管中 每管加入质粒5µl 每管加入质粒 µ 轻轻旋转EP管 混匀混合物，在冰浴上放置 轻轻旋转 管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入42 的水浴中 放置90s，不要摇动 管 的水浴中， 试管放入 0C的水浴中，放置 ，不要摇动EP管 迅速将试管转移到冰浴，冷却 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出EP管，每管加入LB培养基 取出 管 每管加入 培养基800 µl 培养基 置于37 摇床 摇床（ ），温和震荡 置于 0C摇床（100~150r/min），温和震荡 ），温和震荡45min
聚合酶链反应(PCR): 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用
2 克隆载体的选择和构建
基因工程的载体应具有一些基本的性质： 基因工程的载体应具有一些基本的性质：
1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力 2）分子量尽可能小 3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记 4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点。
重组体克隆的筛选与鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因 此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA 此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA 的阳性克隆。
不含质粒的细菌