微生物大小与数量的测定实验报告

山东大学实验报告2017年11月27日

________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康

一、目的要求

1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。

2.增强微生物细胞大小的感性认识。

3. 明确血细胞计数板计数的原理。

4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、基本原理

一）微生物大小的测定

1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，

需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每格长0.01mm（即

10µm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于矫正目镜测微尺每格的相对长度。

3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格

和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。

4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8µm，

枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3µm。

二）微生物数量的测定

1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少

量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

2.用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载

玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上

3.各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度

一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为

0.lmm3(万分之一毫升)。（本次试验所用血球计数板为25个中方格）

4.计数时，通常数随机五个不相邻中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25，

就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

5.设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，所以对于25个中方格的计数板，1mL菌液中

的总菌数n=A/5×25×10^4×B=50000A·B（个）。

血球计数板

三、器材

1.菌种：大肠杆菌7d鞋面培养物，酿酒酵母24h液体合成培养基培养物。

2.仪器或其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜，移液枪，血球计数板等。

四、操作步骤

一）微生物大小的测定

1.装目镜测微尺

取出右目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

2.校正目镜测微尺

（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。

（2）校正先用低倍镜观察，将镜面测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器

移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺

和目镜微尺所占的格数。

（3）计算由于已知镜台测微尺每格长10µm，根据下列公式即可分别计算处在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（µm）=

用上述方法分别对低倍镜、高背景和油镜进行校正，分别测出在低倍镜、高倍镜和油镜下，

两重合线之间两尺分别所占的格数，并用上述公式计算出不同倍镜下目镜测微尺每格所代表

的长度。

（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分

细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。）

3.菌体大小的测定

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到菌体后，换油镜测定大肠杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出大肠杆菌宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。测定酵母菌时，先将酵母菌培养物制成水浸片，然后用高倍镜测出宽和长各占目镜微尺的格数，最后，将测得的格数乘上目镜微尺（用高倍镜时）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小；可选择有代表性的3~5个细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差。

4.测定完毕

取出目镜测微尺后将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。