原生质体的分离和培养

第十一章原生质体的分离和培养

1 引言

植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。

原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carl．son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。1974年高国楠等开发出了PEG（聚乙二醇）融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法，即电融合技术。

植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。

第一节植物原生质体分离

一、原生质体分离

(一)植物细胞膜电特性和膜电位

植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同(表7-1、表7-2)。了解植物细胞膜的电特性对细胞融合的研究很有-必要。

原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已成为对微生物进行遗传操作的标准方法。利用微生物进行遗传操作研究的优点是：①这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制；②它们的复制周期很短。在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另一个个体的传统方法是有性杂交，它所能进行的范围极为有限，尤其在动物中是这样。就是在植物中，虽然远缘杂交并非不可能，但由于有性不亲合性的障碍，有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种(见第9章和第10章)，这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径(体细胞杂交)。无论是在植物中还是在动物中，细胞融合必须穿越质膜才能完成。植物与动物不同，在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁，相邻的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。主要由于这个原因，体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。只是自1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获得大量

有活力的裸细胞(原生质体)，对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才与日俱增。实际上，这一领域的研究甚至是更晚——1970．年以后——才活跃起来的。

高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。

通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：①原生质体的分离；②培养原生质体并使之再生完整植株；⑧细胞融合；

④把外源遗传物质、细胞器或微生物导人原生质体。本章讨论原生质体分离和培养的技术，现将其主要环节示于图11．1，与体细胞杂交有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的应用将在第12章中讨论。

图11．1 叶肉原生质体的分离、培养和植株再生(71自Bajaj，1977)

11．2原生质体的分离

11．2．1原生质体分离的方法

11．2．1．1机械法

由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是机械法—把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出

完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而，这个方法有明显的缺点：一是产量很低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。

11．2．1．2酶解法

1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。然而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。

首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。在他们分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking(1968)证实，这两种酶也可一起使用。这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。多数研究者现在都使用这种简化的一步法，这种方法的细节见附录11．1。现在市面上有各种酶制品出售(表11．1)．取决于组织性质的不同，它们可以不同配比搭配使用。

表11．1 存厦毕后佐分离审常用的商品醢

由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。据报道，由以下各种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤，

茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞，下胚轴和培养的细胞等。

有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响，一个实验体系所需的最适条件主要是靠经验确定的。在想用一个新的实验系统分离原生质体时，可以参考Uchimiya和Murashige(1974)在烟草培养细胞上所做的工作，和Scott等(1978)在禾谷类植物叶肉组织上所做的工作(见表11．2)。

表11．2在两个物种中原生质体分离的最适条件