蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
简述蛋白质分离纯化的基本方法
简述蛋白质分离纯化的基本方法蛋白质是有机体重要的组成部分，由氨基酸编码，执行了多种生物功能，例如促进新陈代谢，生物合成，免疫等。
为了获得高纯度的蛋白质，必须将其从其他成分中分离和纯化。
这就是蛋白质纯化。
蛋白质纯化的基本方法包括：一、分子大小法蛋白质主要通过分子过滤器来分离和纯化。
该过程基于分子间的亲和性原理，通过过滤器膜的通透性以及不同蛋白质的大小差异将蛋白质从溶液中分离出来。
二、萃取技术萃取技术是基于蛋白质的共沉淀特性，通过不同的有机溶剂来区分和分离蛋白质，将沉淀的蛋白组分收集后，再进行精细回收。
三、离子交换技术离子交换技术也是基于蛋白质的离子属性，采用各类加压装置，以及特殊离子交换模块以及合成模块，来实现将收集物分离筛选后回收。
四、双模立体技术双模立体技术是采用两种不同的液体体系，如水基和有机溶剂基，在不同的状态或浓度下对蛋白质进行再离析技术，从而实现蛋白质的有效分离纯化。
五、凝胶精分技术凝胶精分技术是改良和发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术，主要基于交叉链结构，可以基本上实现同一类分子配体分子完整地分离纯化。
六、共晶引擎技术共晶引擎技术可基于共晶相邻能量差异，通过电荷，配体结合等不同形式来改变分子的邻近能量，从而有效的将蛋白质分离出来。
以上就是蛋白质分离纯化的基本方法，可以从不同的角度神明蛋白质的性质，以达到有效的提纯的目的。
蛋白质的分离纯化对解析有机体内蛋白质的结构和功能，也极为重要。
目前，已经有很多高级的技术和模块来实现蛋白质分离纯化，例如蛋白质分子调控，杂交等。
通过有效利用上述方法，可以有效精细和完整得提纯高纯度的蛋白质。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
四种蛋白纯化方法
四种蛋白纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。
该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。
3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。
可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。
优点：•简单易行，不需要复杂的设备和操作。
•适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。
缺点：•可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。
•沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。
该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。
3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。
4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。
5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。
优点：•可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。
•纯化后的蛋白质纯度较高。
缺点：•操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。
•只适用于分子量差异较大的目标蛋白。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。
该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。
蛋白纯化面试知识问答
蛋白纯化面试知识问答什么是蛋白纯化？蛋白纯化是指从复杂的混合物中分离出目标蛋白质的过程。
蛋白纯化的目的是获得高纯度的目标蛋白质，以便于进一步的研究和应用。
为什么需要蛋白纯化？蛋白质在生物学和生物技术研究中起着重要的作用，但在生物体内存在大量其它分子，如其他蛋白质、核酸、小分子等。
为了研究和利用目标蛋白质，需要将其从复杂的混合物中分离出来，获得高纯度的样品。
蛋白纯化的步骤有哪些？蛋白纯化通常包括以下步骤：1.细胞破碎：将含有目标蛋白质的细胞破碎，释放蛋白质。
2.澄清：通过离心等方法去除细胞碎片、细胞核和细胞器等杂质。
3.分离：利用不同的分离技术，如层析、电泳等，将目标蛋白质与其他蛋白质分离。
4.纯化：通过进一步的分离步骤，获得高纯度的目标蛋白质。
5.洗脱：将目标蛋白质从分离介质中洗脱。
6.浓缩：将洗脱的目标蛋白质浓缩得到较小的体积。
常用的蛋白纯化技术有哪些？常用的蛋白纯化技术包括：1.柱层析：包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
根据目标蛋白质的性质选择不同的柱层析方法。
2.电泳技术：包括凝胶电泳、等电聚焦等。
通过蛋白质的电荷、大小和形状等特性进行分离。
3.过滤技术：包括超滤、微滤等。
根据蛋白质的大小选择合适的滤膜进行分离。
什么是亲和层析？亲和层析是一种利用目标蛋白质与特定配体之间的亲和力进行蛋白纯化的技术。
亲和层析常用于从复杂的混合物中高效选择性地纯化目标蛋白质。
亲和层析的原理是什么？亲和层析的原理是利用目标蛋白质与配体之间的特异性相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和标签等，通过与目标蛋白质结合，实现目标蛋白质的分离纯化。
亲和层析的步骤有哪些？亲和层析通常包括以下步骤：1.准备亲和树脂：将具有亲和配体的树脂填充到柱子中。
2.样品加载：将样品溶液加到亲和树脂柱上，使目标蛋白质与配体结合。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，将目标蛋白质从亲和树脂上洗脱下来。
4.收集纯化的目标蛋白质溶液。
什么是凝胶过滤层析？凝胶过滤层析是一种基于蛋白质大小分离的蛋白纯化技术。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述
一.分子筛（凝胶层析）原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单3.条件温和，对蛋白活性保持率高4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难3.对上样量有要求4.测定柱效困难5.反复使用层析柱困难二.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。
此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。
此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
蛋白纯化过程中的常见问题及解决
蛋白纯化过程中的常见问题及解决策略1.杂蛋白去除在蛋白纯化的过程中，杂蛋白的去除是一个关键步骤。
杂蛋白的存在会干扰目标蛋白的纯度和质量。
通常，我们会使用各种色谱技术（如离子交换、疏水相互作用、凝胶过滤等）来进行杂蛋白的去除。
遇到问题时，可以尝试调整色谱条件，如改变缓冲液pH、离子强度、温度等，以达到更好的杂蛋白去除效果。
2.蛋白回收率低蛋白回收率低可能是由于目标蛋白在提取过程中损失，或者在纯化过程中的某些步骤中没有被完全回收。
为了提高蛋白回收率，可以尝试优化提取和纯化步骤，例如减少剧烈操作，避免过度离心和过滤,使用更温和的缓冲液等。
另外，也可以考虑使用更为高效的纯化方法,如免疫沉淀、标签亲和纯化等。
3.目标蛋白变性在纯化过程中，目标蛋白可能会出现变性，表现为蛋白质构象变化、聚合、沉淀等。
这可能是由于物理或化学因素（如温度、pH、离子强度等）导致的。
为了防止目标蛋白变性，需要密切关注这些因素，并尽量减少它们的变化。
同时，也可以考虑使用蛋白质稳定剂（如糖类、甘油等）来帮助稳定目标蛋白Q4.蛋白纯度不足蛋白纯度不足可能是由于纯化步骤不够完善，或者目标蛋白本身存在一定的杂质。
为了提高蛋白纯度，可以尝试优化纯化步骤，例如增加洗涤步骤、使用更高纯度的试剂等。
同时，也可以采用更为严谨的检测方法（如电泳、质谱等）来帮助评估蛋白纯度。
5.目标蛋白聚集在某些情况下，目标蛋白可能会在纯化过程中发生聚集。
这可能是由于目标蛋白的浓度过高、PH值不合适、金属离子浓度过高或者其他因素导致的。
为了防止目标蛋白聚集，可以尝试降低目标蛋白的浓度、调整PH值、去除金属离子等。
同时，也可以使用一些防止蛋白质聚集的试剂（如表面活性剂、蛋白质稳定剂等）。
6.目标蛋白活性丧失在纯化过程中，目标蛋白的活性可能会受到影响或者完全丧失。
这可能是由于物理或化学因素（如高温、有机溶剂、强酸碱等）导致的。
为了保护目标蛋白的活性，需要尽量减少这些不利因素的影响。
蛋白纯化办法大全及优缺点比较
蛋白纯化方法大全及优缺点比较1.?蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。
硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。
硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。
除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。
蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。
其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
2.缓冲液的更换?虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。
不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。
假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。
新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分别纯化蛋白质的办法及道理（一）应用分子大小1.透析：道理：应用蛋白质分子不克不及透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物资如无机盐.单糖.水等离开.办法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：若何加速透析进程（1）加大浓度差,实时改换透析液（2）应用磁力搅拌器经常应用的半透膜：玻璃纸.火棉和其他材料合成2.超出滤：道理：应用压力和离心力,强行使其他小分子和水经由过程半透膜,而蛋白质留在膜上3.凝胶过滤层析：道理：当不合分子大小的蛋白质混杂物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不克不及进入珠内网状构造,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠裂缝间隙中向下移动.而比孔小的分子不合程度地进入凝胶珠内,如许因为不合大小分子所阅历的路径不合而到分别.成果：大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来（二）应用消融度不同4.等电点沉淀：道理：不合蛋白质具有不合的等电点,当蛋白质混杂物调到个中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全体被沉淀下来..5.盐析与盐溶：道理：低浓度时,中性盐可以增长蛋白质消融度这种现象称为盐溶.当离子强度增长,足够高时,例如饱和或半饱和程度,许多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析（三）依据电荷不合6.SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳道理：经由过程加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键衔接的,分别的状况.电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁徙率不再受蛋白质原有电荷和外形的影响,而重要取决于蛋白质分子量.所以SDS-PAGE经常应用来剖析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量.7.离子交流层析：道理：氨基酸分别经常应用阳离子交流树脂,树脂被处理成钠型,将混杂氨基酸上柱,氨基酸重要以阳离子情势消失,在树脂上与钠离子产生交流,而被挂在树脂上.氨基酸在树脂上联合的稳固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力,决议亲和力的身分有：（1）主如果静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水感化氨基酸与阳离子交流树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0.是以洗脱次序应当是：酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸为使氨基酸从树脂上洗脱下来采取慢慢进步pH和盐浓度的办法。
蛋白纯化方法大全及优缺点比较
蛋白纯化方法大全及优缺点比较1. 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。
硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。
硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。
除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。
蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。
其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
2. 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。
不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。
假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。
新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化方法及问题解答蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
蛋白质纯化常见问题及解决方案
蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。
纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。
然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。
本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。
常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。
然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。
这可能有以下几个原因：1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。
可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。
2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。
常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。
可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。
3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。
合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。
此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。
常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。
这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。
解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施：1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。
2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。
有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。
3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。
常见问题三：蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在，如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。
蛋白质分离纯化实验疑难问题与解答
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题3：超滤过程中流速变慢
原因分析
蛋白质在膜表面的聚集会导致滤过变慢
处理方法
搅拌式超滤装置
勿将样品浓缩到超滤棒接触不到的位置
问题4：盐析后酶失活
低温盐析
整个提取过程低温进行
缓慢均匀加入盐 处理方法 冰浴
预 处 理 粗 分 离 精 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
谢 谢
程正琪 14212030013 林 旋 14212030014 廖飞龙 14212030015
预 处 理 粗 分 离 Байду номын сангаас 分 离
原材料 提取液
破碎 溶解 离心 盐析 超滤 有机溶剂沉淀 透析 凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 电泳
粗提液
精提液
问题6：凝胶层析分辨率低
• 降低流速 • 增加柱长 • 采用直径更小的颗粒 • 选用分离范围更窄的介质 • 清洗柱子中杂质 • 改变样品体积
问题11：高效液相色谱柱压升高
（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向 用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在 10％的稀 硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。 （2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱 内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后， 重新安装上柱头螺丝。 （3）如确定定是盐结晶，用 10%的甲醇 / 水冲洗色谱柱使柱内 盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4）如果因 pH 值使用不当，则很难恢复。
蛋白纯化面试知识
蛋白纯化面试知识1. 背景介绍蛋白纯化是生物学研究中非常重要的一步，它是从复杂的混合物中分离和纯化特定蛋白质的过程。
蛋白纯化技术可用于生物制药、生物化学研究、结构生物学等领域。
在蛋白纯化面试中，考官通常会提问与蛋白纯化相关的知识，下面将介绍一些常见的面试问题和答案。
2. 常见面试问题及答案2.1 什么是蛋白纯化？蛋白纯化是指从复杂的混合物中分离和纯化特定蛋白质的过程。
它包括样品预处理、分离和纯化等步骤。
蛋白纯化的目的是获得高纯度的蛋白质，以便进行后续的实验和研究。
2.2 蛋白纯化的常用方法有哪些？蛋白纯化的常用方法包括：•亲和层析：利用蛋白质与亲和柱上的配体之间的特异性相互作用来实现纯化。
•凝胶过滤层析：根据蛋白质的分子量大小选择合适的凝胶，使较大分子的蛋白质无法进入凝胶孔隙而被分离。
•离子交换层析：利用蛋白质与离子交换柱上固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
•凝胶电泳：利用电场对蛋白质进行分离，分离效果与蛋白质的电荷、分子量有关。
•透析：通过半透膜使目标蛋白质与其他小分子物质分离。
2.3 如何确定蛋白纯化的效果？确定蛋白纯化的效果通常需要进行以下几个方面的检测：•SDS-PAGE凝胶电泳：通过凝胶电泳分离蛋白质，观察蛋白质的相对分子质量和纯度。
•Western blotting：通过将蛋白质转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，进一步确认目标蛋白质的纯度。
•比浊法：利用蛋白质在紫外线下的吸光性来检测蛋白质的浓度。
•酶活性测定：通过检测目标蛋白质的酶活性来评估纯化效果。
2.4 在蛋白纯化过程中可能遇到的问题有哪些？在蛋白纯化过程中，可能会遇到以下问题：•低产量：蛋白质表达量较低，导致蛋白纯化的困难。
•杂质污染：混合物中存在其他蛋白质、核酸或小分子物质，影响目标蛋白质的纯化。
•蛋白质不稳定性：某些蛋白质容易失活或聚集，需要进行适当的条件优化。
•蛋白质结构问题：某些蛋白质存在复杂的结构，需要利用多步骤的纯化策略。
简述蛋白质分离纯化的方法
简述蛋白质分离纯化的方法
蛋白质可是生命活动中超级重要的物质呀！那要怎么把它分离纯化出来呢？这可有不少方法呢！
首先说说盐析法吧。
就是向蛋白质溶液中加入中性盐，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会降低而沉淀出来。
操作起来也不难，先把蛋白质溶液准备好，然后慢慢加入盐，边加边搅拌，注意盐的浓度可不能一下子加太高哦，不然蛋白质可能会变性。
还要注意搅拌要均匀，这样才能保证效果好。
接下来谈谈层析法。
这就像是给蛋白质们设置了一场赛跑，根据它们的不同特性在层析柱中跑不同的速度，从而实现分离。
过程中要注意选择合适的层析柱和洗脱液，这可直接关系到分离的效果呢。
而且操作要精细，不能马虎。
在这个过程中，安全性可是很重要的呀，要避免使用有毒有害的试剂，保证实验人员的安全。
同时，稳定性也得保证，柱子不能漏呀，洗脱液的流速要稳定呀，不然怎么能得到好结果呢。
那这些方法有啥用呢？哎呀，用处可大啦！在生物制药领域，能分离纯化出高纯度的蛋白质药物，这可是能救命的呀！在科研中，能帮助我们更好地研究蛋白质的结构和功能。
优势也很明显呀，比如盐析法简单易行，层析法分离效果好。
就说在新冠疫苗的研发中吧，不就用到了蛋白质分离纯化的技术嘛。
通过这些方法，把新冠病毒的相关蛋白质分离出来，然后进行深入研究和开发疫苗，这多厉害呀！这可实实在在地看到了这些方法的效果呀！
所以呀，蛋白质分离纯化的方法真的超级重要，是我们探索生命奥秘和推动医学发展的有力工具呀！它们就像是一把把钥匙，能打开蛋白质世界的大门，让我们更好地了解和利用蛋白质的神奇力量！。
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蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
在1 x PBS中，10 U/mg蛋白质，4或20℃酶切过夜。
可适当加大酶量或延长酶切时间。
2.1.2．Ni柱纯化注意事项1．新的Ni柱填料存放于20%乙醇中（体积约为1:1）。
在取用前，请先估算目的蛋白质的量，再决定取用的填料体积（Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads）。
填料用量不要大大超过所需量，不然会结合较多的杂蛋白，难以清洗干净。
O冲洗，除去乙醇。
再2．新填料使用前，要先进行处理和平衡。
填料先用ddH2用至少5 CV的buffer进行平衡。
3. 在使用前后，要注意不能让填料放干，不然会影响纯化的效果。
O清洗，3. 每次使用结束后，填料用高浓度咪唑（如500 mM）清洗，再用ddH2最后保存在20%乙醇中。
4. 不推荐Ni柱在柱酶切，这样效率很低。
5. 多次使用后填料需再生。
再生步骤为：5 CV HO→ 3 CV 2% SDS→ 1 CV225% EtOH→ 1CV50% EtOH→ 1 CV75% EtOH→ 5 CV100% EtOH→1 CVO→ 5 CV 100 75% EtOH→ 1CV 50% EtOH→ 1 CV 25% EtOH→ 1 CV H2mM EDTA，pH8.0 →H2O→ 2 CV100 mM NiSO4→ 2 CV H2O→20% EtOH。
2.1.3. Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如 -ME等。
Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。
还可能是由于蛋白质折叠不正常，或折叠时将his tag 包裹在内所致。
可以采用的方法是：1）控制破菌条件，不可以过于剧烈；2）改变buffer条件，可能有利于蛋白质折叠稳定；3）将his tag构建到蛋白质另一端。
2. 杂蛋白很多，无法清洗干净？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行清洗；在破菌或结合时加入少量咪唑（如10 mM）；减少填料使用量。
3. 蛋白质洗脱不下来？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行洗脱；更换buffer。
4. 蛋白质发生降解？更换蛋白质抑制剂，或多种抑制剂混合使用；截取其它truncates。
2.2. GST柱纯化2.2.1．GST柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合，或可以让上清液缓慢流经GST柱（≥6 sec/drop）；2. 在充分混合后，将混有填料的上清load上柱子；3. 用大量的lysis buffer（1 x PBS）清洗GST柱，至没有杂蛋白流出（用bradford 检测）；4. 新鲜配制洗脱液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。
将5-10CV的洗脱液加到柱子上，静置一段时间（如10 min），再缓慢流出（≥6 sec/drop）。
5. 洗脱后酶切：洗脱后的GST融合蛋白质溶液先透析除去reduced glutathione，然后加入PreScission或Thrombin进行酶切。
6. 在柱酶切：在洗脱之前，吸取beads，500 x g离心5 min，弃上清。
然后加入酶液，进行酶切。
PreScission：酶切buffer：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5。
10 U/mg protein，5℃酶切4 hr。
可适当加大酶量或延长酶切时间。
Thrombin：在1 x PBS中，10 U/mg protein，4或20 ℃酶切过夜。
酶切结束后，用3-5 CV的1 x PBS冲洗柱子，收集目的蛋白质。
最后用洗脱液清洗beads上残余的GST和GST融合蛋白。
2.2.2．GST柱纯化注意事项1.GE的Glutathion Sepharose 4B Fast Flow最大结合能力为10 mg protein/ml beads。
2. GST填料使用前用至少5 CV的buffer平衡，buffer的pH范围为：6.5—8.0。
3. GST填料机械强度较差，所以在混合时要注意控制力度和时间。
O 4. 洗脱后，GST填料可用6 M盐酸胍或8 M尿素清洗，再生。
然后用ddH2清洗后浸泡在20%乙醇中。
2.2.3．Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？解决方案有：1）保证充分混匀；2）检测蛋白质溶液的pH值是否在合适范围内；3）检查蛋白质溶液是否加入过多的DTT（> 1 mM）。
2. 目的蛋白质无法洗脱？提高reduced glutathione浓度，但注意不要改变pH值；延长洗脱时间，并不定期吹打；在洗脱液中加入一些非离子型detergents如0.1% Triton X-100。
3. GST切不下来？一般情况下，洗脱后酶切比在柱酶切效率高，所以选择洗脱后酶切；可以提高酶的用量，升高酶切温度，延长酶切时间；更换相应载体，用另一种酶进行酶切。
2.3. IgG纯化纯化操作流程如下：2.3.1．制备单克隆抗体1. 购来F1代小鼠，或Bab/c小鼠，饲养一周；2. 腹腔注射Plaston 200 ul/只，饲养10天；3. 将特定细胞注入腹腔；4. 一周起观察小鼠腹水的产生的情况，随时采集腹水。
2.3.2．硫酸铵沉淀1. 取来的腹水用生理盐水以1:1比例稀释；2. 稀释后腹水用滤纸过滤，去除脂蛋白及杂质，得到澄清的上清溶液；3. 在上清中缓慢地边搅拌边加入等体积硫酸铵饱和溶液（4 ℃下操作）；4. 随硫酸铵加入量的增加，溶液逐渐变混浊，加完后再搅拌10 min左右，4 ℃过夜；5. 将放置过夜的悬浊液4 ℃，7000 rpm离心20 min，弃上清，得到乳白色沉淀；6. 用适量50%硫酸铵重悬沉淀，重复以上操作一次，沉淀-30 ℃保存备用。
2.3.3．亲和层析1. 将经20mM PBS，pH7.4透析过夜的腹水与ProteinA 混合过夜；2. 将混合过夜的样品上柱，收集流出液；3. 用20mM PBS，pH7.4 buffer洗柱子，约10个柱体积；4. 用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，洗脱前预先在每个EP管中加入50 ul中和溶液（2M Tris)。
5. OD280读数；6. 亲和力好的，将流出液与ProteinA重新混合，4 ℃过夜，准备第二次、第三次纯化；亲和力不理想的，将流出液再与ProteinG 混合，4 ℃过夜；7．电泳鉴定。
2.3.4．IgG的Fab片段的获得2.3.4.1．木瓜蛋白酶酶切方法1. 酶切体系如下：0.5 M EDTA 1 ul1 M cystine 100 ul10 mg/ml papain 6 ul酶切缓冲液1767 ul（0.1 M NaAc，1 mM EDTA，用醋酸调pH值至5.5）37 ℃激活10 min；2. 在上述酶切反应体系中加入16 mg/ml的mAb共126 ul，反应总体积为2 ml，将反应液于37 ℃酶切5 hrs；3. 封闭：避光加入92 mg/ml Iodoacetamide (IIA) （碘乙酰酶）326 ul ，避光反应40 min ；4. 透析：对20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，更换2次。
2.3.4.2．阴离子交换柱（5 ml Q FF 柱）纯化Fab 片段 阴离子交接缓冲液：Buffer A ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9；Buffer B ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，1 M Nacl (含0.02% NaN 3)。
以50 min 时间梯度达至100% buffer B ；约4分钟后开始出现蛋白峰，其中峰1为Fab ，如下图所示。
PEAK I PEAK II PEAK IIPEAK I3. 凝胶过滤3.1. 操作流程（配合AKTA操作）1. 在使用分子筛之前，请先确定目的蛋白质在过分子筛的buffer中是稳定的。
如果目的蛋白质所处的buffer和过分子筛的buffer有所不同时，请确定在溶液改变过程中目的蛋白质不会发生沉淀。
否则，不可以进行凝胶过滤操作。
2. 根据蛋白质的分子量大小、总量、总体积和实验目的，选择合适的分子筛进行实验。
24 ml分子筛价格较高且使用寿命较短，所以它仅用于定性分析或蛋白质提取困难且总量较少时的纯化，不可以用于大规模纯化。
3. 使用者用自己的账户登录，将分子筛分子筛连接到AKTA上，先后用新鲜配O和buffer平衡柱子（至少1.5 CV），至基线走平。
置并除气的ddH24. 蛋白质样品上样前必须高速离心13000 rpm x 10 min，取上清上样。
5. 在出峰时进行样品的收集。