引物设计常见问题与解答
引物设计的原则以及常见引物设计软件的使用
450-500 P.E.
# range. ——p70,oligo7 manual
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
与primer premier6界面类似，增加了设计引物的种类，可用于设
计各种实时定量的引物和探针，分子信标等。
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
一 前言
如何设ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ引物？
遵循引物设计的原则 设定引物的一些参数 利用引物设计软件搜索，评价引物
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二 引物设计原则
1.引物的长度
引物的长度一般选择在18-27个碱基之间，过长和过短都会降 低引物结合效率。
2.引物的Tm值
引物的Tm值一般选择在55-65℃之间，上下游引物之间Tm相差 不宜超过4℃。 Tm值：两段互补的碱基序列解链50%时的温度 估算Tm=4*(G+C)num+2*(A+T)num
此外，Beacon Designer增加了标记外显子的选项，使得方便设计跨外 显子的引物，提高实时定量引物的特异性。 Locate exon + Junction Primer serach
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
导出引物信息为表格文件-Export Results
引物设计的原则以及
常见引物设计软件的使用
伏东科 20150618
目录
一 前言 二 引物设计原则 三 常用软件使用方法
四 常见问题
一 前言
什么是引物？
引物（primer），又称引子，是一小段单链DNA或RNA，用来作 为DNA复制的起始点（终点）。
引物设计知识点汇总
引物设计知识点汇总引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用。
引物是用于特异性扩增DNA片段的短寡核苷酸序列，需要准确设计以保证扩增效率和特异性。
本文将汇总引物设计的相关知识点，包括引物选择、引物设计策略和引物设计工具等。
一、引物选择引物的选择是引物设计的第一步，关键点如下：1. 引物长度：一般选择18-22个碱基对的短寡核苷酸作为引物长度，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则增加了扩增难度。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致不稳定的引物结合和扩增效率下降。
3. 引物的翻译调谐能力：引物的序列应尽可能避免出现自身互补的二级结构，避免引物之间的相互结合，以保证扩增特异性。
4. 引物的特异性：引物应具有较高的特异性，即只特异性地扩增目标DNA片段，而不扩增非目标DNA。
二、引物设计策略在引物设计过程中，有以下几种常用的引物设计策略：1. 引物序列比对：将引物序列与目标序列比对，选择引物与目标序列高度互补的区域作为引物的设计区域。
2. 引物性能评估：使用引物设计工具对设计的引物进行性能评估，评估指标包括特异性、互补性、剪切位点等。
3. 引物序列调整：根据引物评估的结果，对引物序列进行调整，如调整引物的长度、GC含量等。
4. 引物结构优化：通过调整引物的二级结构和碱基组成，优化引物的稳定性和特异性。
三、引物设计工具引物设计工具可以帮助研究人员快速设计合适的引物，常见的引物设计工具有：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计软件，提供了丰富的设计选项和参数调整，可以根据用户需求生成高质量的引物序列。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST结合了引物设计和引物特异性评估的功能，能够为用户提供特异性较高的引物设计方案。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款在线工具，可以评估引物的各项性质，如熔解温度、稳定性等。
引物测序直播问题及回答
1、我想问下：为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度呢？两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。
2、老师您好，我想自己设计测序引物，请问对于测序引物有什么要求吗？在待测目的基因前面100bp左右设计引物，GC含量不能太高或太低，3’端不能有错配，引物的长度建议是18-20bp以内。
3、甲基化的建议反向测序,是什么意思?正向测序有甲基化的结构，会导致测序峰图双峰或者严重的时候导致信号突然中断，就可以反向测序，然后正反双向测序结果拼接起来就可以得到完整的序列。
4、老师请问一个测序反应有效的大概有多长?普通序列一个测序反应有效长度大概是800bp左右。
5、请问RNA最长能合多少呢30bp以内。
6、稀释后引物保存时间多久？稀释后的引物一般4℃保存3个月内是没有问题的7、你们的积分的兑换时间有限制吗？积分不清零的8、测序为什么前70bp不准呢一代测序，由于仪器的缺陷，所以前面会有几十bp是不准确的，严重的时候会有70bp左右不准确。
9、老师请问那引物最长能合多长呢？引物最长能合139bp。
10、金开瑞引物合成与外面其他公司引物合成相比，优势有哪些？我们公司技术服务内容比较多，内部和外部引物合成需求都是一起合成，效果和质量的反馈方面，我们综合有内部使用和外部使用反馈，更全面。
11、只做常规的pcr，用什么纯化方式的引物呢?常规的pcr脱盐纯化就可以满足实验了。
12、引物测序时，单向、双向、测通之间的具体区别是什么呀？这个主要是根据待测目的序列的长度来决定的，如果待测目的序列700bp以内的话可以选择正向或者反向都行；1500bp以内的序列一般双向测序就可以了；如果是待测目的序列大于1500bp就可以填测通，这边会根据测序结果自动安排测序反应，直到完全测通，我们会默认测通后拼接。
13、不同纯化方法,你们收费不一样是吗不一样的，脱盐纯化<PEGA纯化<HPLC纯化。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。
1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。
室温保温1小时，或4oC过夜。
在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用Agarose 电泳来进行定量了）。
引物设计知识点总结
引物设计知识点总结引物是在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的一种技术。
它主要用于DNA或RNA的扩增、测序和检测等实验。
引物设计的质量和准确性对实验结果有着重要的影响。
本文将对引物设计的知识点进行总结和讨论。
一、引物设计的基本原则引物设计需要考虑以下几个基本原则：1. 引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间。
过短的引物可能导致扩增效率低下，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
2. 引物温度：引物的熔解温度（Tm）应在50-65摄氏度之间。
引物的Tm过高可能导致非特异性扩增，而过低则可能导致扩增效率下降。
3. 引物结构：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的3'端应尽量避免含有GC丰富序列，以减少引物自身的二聚体形成。
二、引物序列的选择在引物设计中，需要根据具体的实验目的和DNA序列来选择引物的序列。
以下是常见的引物序列选择策略：1. 引物长度：引物的长度一般为18-30个碱基对。
对于较短的DNA序列或需要快速扩增的实验，可以选择较短的引物；对于复杂的基因或需要高度特异性扩增的实验，可以选择较长的引物。
2. 引物位置：引物应位于目标序列的末端，以提高特异性。
通常，引物应位于目标序列的保守区域，并避免位于变异或多态性较高的区域。
3. 引物序列：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的GC含量应适中，避免过高或过低。
三、引物设计工具为了帮助科研人员进行引物设计，许多在线工具和软件被开发出来。
以下是一些常用的引物设计工具：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，可以根据用户输入的序列和参数，自动设计引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST可以在设计引物的同时，对引物与目标序列的特异性进行评估。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer可以评估引物的物理属性，如熔解温度和GC含量，并检查引物是否存在二聚体结构。
引物设计常见问题与解答
引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
引物设计注意问题
引物设计注意问题1．3，端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。
2．3，端的△G不宜过高，过高会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，其绝对值应该小一些，最好不要超过9。
3．发夹结构（Hairpin Formation）△G绝对值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
4．上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。
5．Tm 值可以控制在50～70度之间。
6．错配（False priming）一般的原则要使错误引发效率在100以下。
7. 等级评定（rating）搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。
8. 内部稳定性（Internal stability）一般引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
△G绝对值越大结构越稳定。
9. 3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下。
10. GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。
11. GC钳（GC Clamp）一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。
这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。
选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于 3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
12. 二聚体（Dimer）3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。
13. 如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的（16～18 mer）的引物：若产物长5 kb，则用20～23 mer的引物。
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分一、引物特异性问题引物特异性是PCR技术中的关键问题之一，它直接影响到PCR 产物的数量和纯度。
引物特异性主要取决于其与模板序列的匹配程度。
以下是一些引物特异性相关问题：1. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成对引物特异性有一定影响。
一般来说，引物长度适中，不宜过长或过短。
碱基组成上，避免使用GC含量过高或AT含量过低的引物，以免影响引物的稳定性。
2. 模板序列变化：模板序列中任何微小的变化都可能导致引物与模板的错配，从而影响PCR产物的数量和纯度。
因此，在设计和选择引物时，应仔细考虑模板序列的变化，确保引物与模板序列的匹配度。
3. 酶切位点的干扰：如果模板序列中含有酶切位点，则需要注意酶切位点对引物特异性的影响。
在设计引物时，应避免将酶切位点设计在引物自身或与其互补的序列中，以减少错配的可能性。
二、引物自身互补问题PCR过程中，引物自身互补也是常见的问题之一。
引物在退火过程中可能会发生自身互补，从而导致非特异性产物的产生。
以下是一些关于引物自身互补的相关问题：1. 引物浓度和退火温度：引物浓度和退火温度是影响引物自身互补的重要因素。
降低引物浓度或提高退火温度可以减少引物自身互补的可能性。
2. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成也会影响引物自身互补的可能性。
选择适当的引物长度和碱基组成，可以提高引物的稳定性，减少自身互补的发生。
三、其他相关问题1. Mg2+浓度的影响：Mg2+浓度是PCR过程中的关键因素之一。
过高或过低的Mg2+浓度都可能导致PCR产物的数量和纯度受到影响。
在设计和优化PCR反应体系时，应注意Mg2+浓度的选择。
2. 延伸温度的选择：PCR产物延伸温度也是影响PCR产物的数量和纯度的因素之一。
选择适当的延伸温度可以减少非特异性产物的产生，提高PCR产物的纯度。
总之，在高中生物学PCR技术中，引物特异性、引物自身互补和其他相关问题是需要关注和解决的。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是生物学和生物技术领域中非常重要的一个环节。
在分子生物学研究、基因工程、医学诊断、疾病预防等方面，引物设计都起着至关重要的作用。
引物设计的好坏直接影响到PCR扩增、序列特异性分析、RNA干扰、原位杂交、基因克隆等实验的效果和结果。
因此，深入理解引物设计的相关知识点对于提高实验效率和结果的可靠性非常重要。
本文将介绍引物设计的相关知识点，并对其进行归纳总结。
1. 引物设计的基本原则引物是在分子生物学实验中用于对特定DNA或RNA序列进行扩增、检测或特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列。
设计好的引物对于实验的成功至关重要，而引物设计的基本原则包括：(1) 引物长度：引物长度一般在18-25碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低，而过长的引物可能导致特异性差。
(2) GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的结合性能和特异性。
(3) 引物序列选择：引物的序列选择要尽量避免重复序列、近似重复序列和具有高度变异性的区域。
(4) 引物特异性：引物的特异性是指引物能够与目标序列特异性结合，而不结合其他非特异序列，引物特异性的好坏直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
2. 引物设计的常见问题及解决方法在引物设计过程中，常常会遇到一些常见问题，例如引物特异性不足、引物二聚体形成、引物偏向性扩增等问题。
针对这些问题，有一些解决方法可以参考：(1) 引物特异性不足：可以通过生物信息软件对引物进行预测和评估，合理选择引物序列，避免与非特异序列发生交叉杂交。
(2) 引物二聚体形成：引物二聚体是指引物之间相互结合形成二聚体，导致引物的扩增效率降低。
可以通过调整引物长度和序列，以及优化PCR扩增条件来避免引物二聚体的形成。
(3) 引物偏向性扩增：引物偏向性扩增是指引物对特定序列的扩增效率高于其他序列，可以通过优化PCR扩增条件，如调整引物浓度、反应体系等来解决。
引物设计知识点总结图解
引物设计知识点总结图解引物设计是分子生物学研究中至关重要的一步，它涉及到DNA/RNA的扩增、测序和定量等诸多实验。
本文将通过图解的方式，对引物设计的相关知识点进行总结。
具体涉及引物设计的基本原则、引物长度、引物序列的选择、引物的特异性、引物的GC含量以及二聚体的形成。
希望通过本文的阐述，读者能够更好地理解引物设计的要点和注意事项。
1. 引物设计的基本原则引物设计的基本原则包括：引物长度适当、引物序列具有特异性、引物的理论特性符合要求、引物的二聚体形成能力低等。
2. 引物长度的选择引物长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物容易出现非特异性扩增产物，而过长的引物则可能导致扩增效率降低。
因此，在设计引物时需要注意选择适当的长度。
3. 引物序列的选择引物序列的选择是引物设计过程中的核心步骤。
引物的序列应在目标区域能够满足特异性，避免与非目标区域有较高的同源性。
此外，引物序列的碱基组合应尽量避免存在重复序列、多聚碱基或者易形成二聚体的碱基组合。
4. 引物的特异性引物的特异性是评价引物设计质量的重要指标之一。
合理设计的引物应能够特异性地与目标DNA/RNA序列配对，并能够排除与非目标序列的配对。
特异性的引物可以有效地避免非特异性扩增产物的生成。
5. 引物的GC含量引物的GC含量对扩增反应的效率和特异性具有重要影响。
过高或过低的GC含量均可能导致扩增效率降低或产生非特异性扩增产物。
因此，在设计引物时需要合理调整引物的GC含量，并确保GC含量在适宜的范围内。
6. 引物的二聚体形成引物的二聚体形成是指引物之间可能发生的相互结合。
合理设计的引物应该不能形成稳定的二聚体，以避免引物在扩增反应中发生错误的配对，导致产物的异常。
通过上述的图解，我们可以清晰地了解引物设计的主要知识点和注意事项。
在实际的引物设计过程中，需要根据具体的实验目的和条件选择合适的引物设计策略，并结合生物信息学工具进行引物序列的设计和评估。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。
Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析1、如何溶解引物？干燥后的引物质地非常疏松，开盖前需先离心，将引物粉末收集到管底。
根据说明书上的公式计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。
2、如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
溶解前的引物在室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需避光保存。
3、测序发现引物有突变是怎么回事？测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率很小，但是也会存在。
您所提交引物序列一般是通过电脑直接COPY到合成仪的，我们也有一套控制办法，预防碱基输入错误，基本不存在人工输错的现象。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高为99%，副产品不可以避免。
在合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在。
引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT，导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。
缺失突变，一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。
被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。
对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。
置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。
碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。
引物设计常见问题
引物设计常见问题引物设计常见问题与解答(⼆)17. 长链引物为什么出错的⼏率⾮常⾼答：引物合成时，每⼀步反应效率都不能达到100%,产⽣碱基插⼊，缺失，置换突变的因素客观条件都有⼀直存在。
引物链越长，突变的频率累加起来就越⾼。
研究⼈员总希望合成的引物万⽆⼀失，这种⼼情可以理解。
但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。
要知道，引物合成中发⽣错误（⾮⼈为因素）的频率，⽐任何⾼保真⾼温聚合酶PCR扩增过程所产⽣的频率都要⾼。
做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18. 如果测序发现突变，该如何处理答：对您遇到的困惑，我们表⽰同情。
遇到这种情况，⾸先和我们取得联系，我们的⽣产⼈员会检查⽣产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单⼀致，我们在电脑中保留所有原始数据。
如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。
根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是⽤于全⽚段拼接合成的，就需要多测⼀些了。
⼀般情况下，每个克隆突变的位点都不⼀样，提⽰正确的总是有的，就是如何找到它。
您也可以要求我们将引物免费重合⼀次，不过重合的引物和第⼀次的引物⼀样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的⼏率。
基因拼接过程中，如果发现⼀段区域突变点不多，就多测⼏个，否则就重合⼀下引物。
19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿答：没有。
我们可以免费重合⼀次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。
原因我们在前⾯已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中⼀些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。
20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插⼊答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间⼀个碱基的差别。
但是制备PAGE电泳，上样量都是⾮常⼤，电泳时的条带⾮常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收⽬的引物时，很难说不割到差别仅⼏个碱基的引物。
设计pcr引物的注意事项
设计pcr引物的注意事项
设计PCR引物的注意事项包括以下几点：
1.引物长度：一般为15～30个碱基，引物太短会降低扩增特异性。
引物过长退火温度会提高，不利于反应的发生。
2.引物序列：设计引物时碱基要随机分布，避免碱基或核苷酸的重
复导致错误引发；引物间和引物自身序列也要尽量避免互补，防止形成引物二聚体或发夹结构。
3.碱基分布：GC含量一般40-60%，含量过高或过低都不利于进行
反应。
其含量过低会使引物不稳定；过高会引发非特异性扩增。
4.Tm值：引物的Tm值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T），尽可能
保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。
5.引物设计好后进行BLAST检查，检测是否与基因组中重复序列或
其它基因位点有交叉同源。
6.引物的特异性：引物的3'端如果含有一个G或C残基能增加引物
的特异性。
请注意，以上仅为PCR引物设计的基本原则，具体操作时可能还需要考虑其他因素，建议咨询专业人士获取帮助。
设计pcr引物的注意事项 -回复
设计pcr引物的注意事项-回复设计PCR引物是进行聚合酶链式反应（PCR）的关键步骤之一。
PCR引物是双链DNA的起始序列，通过与待扩增的目标DNA序列的互补配对，指导PCR反应的进行。
正确设计PCR引物可以确保PCR反应的稳定性和高效性。
下面将详细介绍设计PCR引物的注意事项，并提供一步一步的具体指导。
第一步：了解目标序列在设计PCR引物之前，首先需要了解待扩增的目标序列。
要知道目标序列的长度、碱基组成、GC含量、核酸折叠和二级结构等。
这些信息将有助于精确选择PCR引物的长度和碱基配对，以确保引物与目标序列的特异性结合。
第二步：确定PCR引物的长度PCR引物通常由15-30个碱基组成，理想情况下，引物的长度应在18-25个碱基之间。
引物过短可能导致非特异性扩增，引物过长可能导致扩增效率较低。
根据目标序列的长度进行调整，通常在PCR反应中会使用两个引物，分别位于目标序列的两端。
第三步：确定PCR引物的GC含量PCR引物的GC含量是设计引物时需要考虑的重要因素。
GC含量过高或过低都可能导致非特异性扩增或扩增效率低下。
理想的PCR引物GC含量应在40-60之间。
可以使用计算软件或在线工具计算引物的理论Tm（解链温度），并调整引物的碱基组成以达到理想的GC含量。
第四步：避免引物之间的配对在设计PCR引物时，需要确保引物之间没有互相配对的情况。
引物之间的相互配对可能导致引物与引物之间的二聚体形成，从而降低PCR反应的效率。
使用在线工具或计算软件能够有效检查引物之间的互相配对情况。
第五步：避免引物与非特异序列的互补配对设计PCR引物时，还需要避免引物与非特异序列的互补配对。
非特异性扩增会导致PCR产物的污染，降低特异性。
通过使用基因组数据库或基因组浏览器等工具，确定引物与非特异序列的互补配对情况。
最好避开与非特异序列有互补性的区域。
第六步：检查特异序列的重复序列和变异位点在设计PCR引物时，还需要仔细检查引物与目标序列特异区域是否有重复序列或变异位点。
例析pcr引物的设计原则问题
例析pcr引物的设计原则问题
PCR引物的设计原则包括以下几个方面：
1. 引物长度：引物的长度通常在18到30个碱基对之间。
引物过短可能导致特异性不足，引物过长可能导致引物之间的杂交。
2. Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55到65摄氏度之间。
过低的Tm可能导致非特异性扩增，过高的Tm可能导致引物无法结合到目标序列上。
3. GC含量：引物的GC含量通常在40%到60%之间，过高的GC含量可能会增加温度的Tm，降低特异性，过低的GC含量可能会导致引物与目标序列的结合较弱。
4. 特异性：引物的特异性非常重要，在设计引物时需要避免与目标序列以外的序列发生杂交。
可以通过BLAST等工具来验证引物的特异性。
5. 引物之间的杂交：如果设计多对引物进行多重PCR反应，则需要避免引物之间的杂交，这可能导致产物的偏离预期大小或无扩增。
6. 避免二聚体形成：引物在自身之间也需要避免形成二聚体，这可能导致PCR反应的效率降低。
7. 引物末端修饰：可在引物末端加入磷酸化、biotin等修饰物，以便于后续的操作和检测。
综合考虑上述原则，可以使用一些辅助软件或在线工具进行引物设计，如Primer3、OligoAnalyzer等，以提高引物的特异性和PCR反应的效果。
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引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm 时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。
简单的计算公式可以用2+4的公式。
若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。
引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。
自己可以再估计一下。
如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。
引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。
一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer 计算出来的。
1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-ECTOR 或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意上面是我以前在园子里看到的精彩的帖子，所以收藏了一下.上面说的比较明白.如果加上酶切位点和保护碱基,计算出来的Tm一般教高,而我们设的退火温度原则是Tm-5,一般都是用55度左右，所以我坚持我的观点.不要算进去。
1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.投诉定量不准是怎么回事儿？答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生产人员定量错误。
这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。
公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。
合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。
一般情况下，引物都有留样。
接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。
这种情况很少见。
（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。
使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。
（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。
这种情况比较常见。
（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。
5.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
6.最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。
我们合成过120base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。