PCR常见问题分析(无、非特异、拖尾)

PCR常见问题、原因分析及其对策

镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降；镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增效果，因此需要确保模板的纯度和浓度，避免使用降解严重的模板，以提高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时，合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视，提高模板质量可以提高pcr的产量和特异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质，这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。

pcr2

PCR常见问题PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。

PCR扩增过程中常见的问题及解决方法

PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。

目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展P CR研究用应用工作。

PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。

在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。

为了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。

一、假阳性扩增在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手：⒈试剂污染：厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。

检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。

⒉实验室污染：这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。

扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。

判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。

当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。

解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。

PCR常见问题分析及对策

.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

pcr跑胶结果出现拖尾的解决方法

pcr跑胶结果出现拖尾的解决方法
PCR跑胶结果出现拖尾可能是由于以下原因导致的：
1. DNA模板浓度过高：过高的模板浓度可能导致PCR反应过度扩增，
出现拖尾现象。

可以尝试减少DNA模板的量或稀释模板，以降低浓度。

2. DNA模板质量差：低质量的DNA模板可能导致PCR反应不特异性扩增，产生拖尾。

务必使用高质量、纯净的DNA模板。

3. 引物浓度过高：过高的引物浓度可能导致引物间的非特异性结合，
导致拖尾。

可以尝试降低引物的浓度。

4. 扩增条件不合适：PCR反应的温度和时间设置不当也可能导致拖尾
现象。

建议优化PCR反应条件，包括温度梯度法优化退火温度和延长
扩增时间。

5. 酶的活性过高：过高的酶活性可能导致PCR反应过度扩增，产生拖尾。

可以尝试减少酶的用量。

6. 存储条件不当：PCR试剂的存储条件可能会影响其稳定性和效果。

确保试剂在正确的温度下存储，并避免阳光直射和湿度过高。

根据实验情况综合考虑以上因素，逐一排查和优化，可以有效解决PCR 跑胶结果出现拖尾的问题。

如果问题仍然存在，建议寻求专业技术人
员的帮助。

PCR常见问题分析及计谋无扩增产物、非特异性扩增、拖尾

PCR常见问题分析及计谋(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品那么无原因:1.模板:含有抑制物，含量低对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与估量的大小不一致或非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯不合适3.退火温度偏低4.酶量过多、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照显现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

PCR常见问题及对策

PCR常见问题及对策（一）没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。

Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。

特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5－10分钟。

（5）引物变质失效。

人工合成的引物是否正确。

是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）使用PCR试剂盒时还应注意：①是否严格按照说明书操作；②试剂使用前是否充分混匀；③试剂储存过久或不当而失效。

（二）扩增产物在凝胶中涂布或成片状（1）酶量过高。

减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。

减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。

可适当降低其用量。

（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（5）退火温度过低。

（6）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。

（7）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

（三）溴酚蓝前有区带（很宽）（1）模板量太低。

增加模板DNA的用量。

（2）循环次数太多。

减少循环次数。

（3）复性度偏低。

提高复性温度。

（4）预变性后没有立刻上机循环。

（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。

（6）引物用量偏多。

降低引物的使用量。

（四）扩增产物出现多条带（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。

应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。

适当增加模板的量，减少循环次数。

PCR常见问题及解决方法

PCR常见问题及解决方法PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。

b)、扩增体系配制错误：重复实验。

c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。

d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。

2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。

b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。

c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。

3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。

b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。

4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。

b)、多扩几管，胶回收浓缩。

5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。

b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。

PCR 常见问题及解决方案

PCR 常见问题及解决方案1没有扩展条带可能的原因及对应的解决方案如下：酶失活或在反应体系中未加入酶。

Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

模板含有杂质。

特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA 脱嘌呤而影响PCR 的结果。

变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq 酶以前，将反应体系95℃加热5~10 分钟。

引物变质失效。

人工合成的引物是否正确。

是否纯化，或因储存条件不当而失活。

引物错误。

利用BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA 凝胶和PCR 程序的问题。

2PCR 产物量过少可能的原因和对应的解决方案如下：退火温度不合适。

以 2 度为梯度设计梯度PCR 反应优化退火温度。

DNA 模板量太少。

增加DNA 模板量。

PCR 循环数不足。

增加反应循环数。

引物量不足。

增加体系中引物含量。

延伸时间太短。

以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

变性时间过长。

变性时间过长会导致DNA 聚合酶失活。

DNA 模板中存在抑制剂。

确保DNA 模板干净3扩增产物跑电泳条带弥散可能的原因和对应的解决方案如下：酶量过高。

减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

dNTP 浓度过高。

减少dNTP 的浓度。

MgCl₂浓度过高。

可适当降低其用量。

模板量过多。

质粒DNA 的用量应<50 ng，而基因组DNA 则应<200 ng。

引物浓度不够优化。

对引物进行梯度稀释重复PCR 反应。

循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR 循环。

退火温度过低。

电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。

若为PCR 试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

PCR常见问题及解决办法

问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

PCR常见问题及解决方案

一、普通PCR常见问题及解决对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。

1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

1.1 模板①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

1.2 酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

1.3 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

1.4 Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

1.5 反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

PCR常见问题及解决方法

PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。

b)、扩增体系配制错误：重复实验。

c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。

d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。

2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。

b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。

c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。

3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。

b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。

4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。

b)、多扩几管，胶回收浓缩。

5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。

b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。

PCR常见问题分析与对策

PCR常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

PCR常见问题分析及对策

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

PCR常见问题及解决方案

PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。

PCR常见问题分析(无、非特异、拖尾)

问题1：无扩增产物现象：正对照有条带,而样品则无原因：1.模板：含有抑制物，含量低2。

Buffer对样品不合适3。

引物设计不当或者发生降解4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4。

降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1。

引物特异性差2。

模板或引物浓度过高3。

酶量过多4。

Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6。

循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3。

适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1。

模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5。

dNTP、Mg 2+浓度偏高6。

循环次数过多对策:1。

纯化模板2。

更换Buffer3。

适当提高退火温度4。

适量用酶5。

适当降低dNTP和镁离子的浓度6。

减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交＊污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2。

除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3。

各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

跑胶拖尾——精选推荐

电泳出现拖尾现象，英文成为smear，就是弥散。

其原因，主要从以下两个方面考虑：
1、PCR产物自身原因：
往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。

对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。

2、电泳体系的问题：
（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。

（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。

（3）电压太高。

（4）适当把你的胶的浓度加大。

（根据你的片断大小而定）（5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。

如果连MAKER都没有跑开，那就应该是胶的问题了。

先把胶做好了再跑试试看1%的琼脂糖凝胶跑DNA应该是可以的
我感觉可能
1 胶放置的时间不够还没有完全凝固因此跑的乱
2.做胶的时候琼脂糖是否已经完全溶解了再倒的板子？
这两个可能性最大。