荧光PCR结果分析
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线,按照标准曲线计算。
一般都就是相对量。
则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。
举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。
实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。
ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。
２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。
2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。
但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。
必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。
2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。
最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
定性和定量测定结果报告上的混淆。
为什么要做定量测定？
用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果 的动态观察及抗病毒药物的临床研究； 用于基因表达方面的研究，如特定的 mRNA的定量测定。
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
定量和定性测定的结果报告
报告中所应具备的信息
标题，例如“检测报告” 报告的唯一性标识（如序号） 检测标本的特性和状态 检测标本的接收时间和进行检测的时间 采用的检测方法 实验操作及校核人员的签字，以及签发日期 检测报告中应给出参考结果或范围
谢谢！
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。 定性测定结果报告:报告“阳性”或“阴性”, “检出” 或“未检出”, “反应”或“未反应”
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。 参比（Reference） 用于对检测结果进行标准 化的被动（Passive）或主动（Active）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
荧光测定pcr实验报告
荧光测定pcr实验报告引言聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增DNA 目标序列。
PCR扩增过程中，荧光标记的探针可以用来监测DNA模板的定量。
本实验旨在通过荧光测定PCR的方法，对指定DNA序列进行定量分析。
实验设计与方法实验设计1. 收集样本：收集待测DNA样本。
2. 准备试剂：准备PCR反应体系所需的试剂，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等。
3. 试剂配置：按照实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液。
4. PCR反应：根据实验设计，进行PCR反应，在PCR仪中设置加热曲线。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，通过荧光实时监测相应信号。
实验方法1. 收集样本：收集待测DNA样本，保证样本的纯度和完整性。
2. 准备PCR反应体系：按照实验设计，配置PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等，保证试剂的浓度和质量。
3. 试剂配置：根据实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液，保证试剂的稳定性和反应效果。
4. PCR反应：将待测DNA样本和试剂混合，在PCR管中进行适当的温度变化，进行PCR反应。
PCR反应的参数包括初始变性、循环变性、退火、延伸等步骤。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，监测PCR反应产生的荧光信号。
通过荧光实时监测，可以定量分析PCR扩增的产物。
结果与分析荧光测定PCR结果在本实验中，通过荧光测定PCR的方法成功扩增了目标DNA序列。
在PCR反应过程中，实时监测到荧光信号的增强，表明DNA扩增的过程正常进行。
荧光信号定量分析结果通过荧光信号的实时监测，可以进行PCR扩增产物的定量分析。
扩增产物的荧光信号强度与初始模板DNA的浓度成正比，因此可以通过荧光信号的强度来估计初始模板的浓度。
数据处理与统计分析对实验得到的数据进行处理和统计分析，可以得到PCR扩增产物的浓度。
通过与标准曲线的比较，可以确定PCR产物的浓度。
结论本实验成功使用荧光测定PCR的方法扩增了目标DNA序列，并进行了定量分析。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR数据分析
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量pcr检测报告怎么看
荧光定量pcr检测报告怎么看荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性、快速、准确的分子生物学检测方法。
它广泛应用于疾病诊断、药物研究和生物学研究等领域。
在进行PCR检测后，我们需要仔细阅读PCR检测结果所得到的荧光定量PCR检测报告。
但是，对许多人来说，阅读PCR检测报告是一件比较困难的事情。
因此，本文将介绍荧光定量PCR检测报告的几个主要部分及其含义，希望能够对各位有所帮助。
荧光定量PCR检测报告通常由以下几个部分组成：1. 标本信息：包括检测样本的类型、编号、采集时间等信息。
2. 检测结果：主要包括所检测的目标基因、荧光定量PCR检测值、检测下限、灵敏度等参数。
3. 样本质控：主要包括PCR扩增曲线、熔解曲线、负轨迹、标准曲线等信息。
4. 结论：根据所检测的目标基因的荧光定量PCR检测值和检测下限，判断样本是否为阳性或阴性。
那么，如何读取荧光定量PCR检测报告呢？一般来说，读取荧光定量PCR检测报告需要注意以下几个方面：1. 检测结果：在检测结果部分，会显示所检测的目标基因的荧光定量PCR检测值。
如果荧光定量PCR检测值大于检测下限，则判断为阳性；如果荧光定量PCR检测值小于检测下限，则判断为阴性。
2. 样本质控：在样本质控部分，将显示PCR扩增曲线、熔解曲线、负轨迹和标准曲线等信息。
通过样本质控部分的信息，可以确定荧光定量PCR检测结果的准确性和可靠性。
3. 结论：根据检测结果和样本质控，得出检测样本的阳性或阴性结论。
如果样本为阳性，则需要进一步进行确认检测和治疗；如果样本为阴性，则可以排除所检测的疾病。
总之，阅读荧光定量PCR检测报告需要认真严谨，对于未知词汇和专业名词需要有一定的了解，以便准确判断检测结果和结论。
希望本文能够帮助大家更好地理解和读取PCR检测报告。
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。
则用delta delta CT方法来计算。
举例如下：
对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。
实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。
2的1次方是2。
也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。
2的2次方是4。
也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。
但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
几点注意：
1。
必须确定扩增的特异性
2。
只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。
2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。
最好不用Syber Green
由Ct值用2^-△△Ct法计算计算表达量差异的原理，可以看下面的图片：
附件的Excel文件是计算用的，感兴趣也可以看看由Ct值是如何一步一步算出2^-△△Ct的。
温馨提示：最好仔细阅读后才下载使用，万分感谢！。
荧光定量PCR实验原理及数据分析
荧光定量PCR实验原理及数据分析1.前处理：首先对待测样本进行DNA提取，并且根据需要可对DNA进行适当的纯化和稀释处理。
2. 反应体系的准备：将PCR反应所需的各种试剂组装到反应管中，包括模板DNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix等。
其中荧光探针是含有特定标记荧光分子及其互补序列的寡核苷酸。
3.反应机使用条件的设定：根据所需扩增目标的不同，设置适当的反应条件，包括温度控制、循环次数和步骤等。
4.PCR反应过程监测：在PCR反应的过程中，通过荧光信号的实时监测来定量检测目标DNA。
在扩增过程中，如果靶标DNA存在，则引物与目标DNA结合，荧光探针被引物酶切释放出来，从而增大荧光信号。
5.数据收集与分析：实时采集PCR反应过程中的荧光信号，并通过相应的软件进行数据分析。
常见的荧光曲线分析方法有阈值循环数法（Ct 法）和相对定量法（ΔCt法）等。
在数据分析方面1.Ct值分析：阈值循环数法（Ct法）是一种常用的数据分析方法。
通过设定一个荧光信号的阈值（通常为反应曲线的背景荧光信号的两倍标准差），根据荧光信号的曲线与阈值的交点来计算Ct值。
Ct值越小，说明目标DNA起始含量越多。
2.标准曲线分析：通过引入已知浓度的标准品，制作一条标准曲线。
根据标准曲线，可以推算出待测样本中的靶标DNA的含量。
3.相对定量分析：采用相对定量法（ΔCt法）来比较两个不同样本间的靶标DNA的表达量。
通过比较目标基因与内参基因（如表达稳定的参考基因）的Ct值，计算两者Ct值间的差异（ΔCt），进而得到靶标基因的表达差异。
4.绝对定量分析：通过构建外部标准曲线或使用串联基因的方法，直接定量目标DNA的浓度。
总之，荧光定量PCR技术在医学、生物学和分子生物学等领域的应用非常广泛，对荧光信号的实时监测及数据分析能够提供准确快速的定量结果，为研究者们提供了一个强大的实验工具。
荧光定量pcr结果怎么看历史数据
荧光定量PCR结果怎么看历史数据什么是荧光定量PCR（qPCR）？荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction），简称qPCR，是一种用于检测和定量特定DNA分子的方法。
它结合了PCR和荧光信号检测技术，可以精确地测定样品中目标DNA的数量。
荧光定量PCR广泛应用于生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域。
荧光定量PCR的结果分析在进行荧光定量PCR实验时，我们常常会得到一组荧光数据。
这些数据代表了不同循环数下目标DNA的荧光信号强度。
1. 阈值周期数（Ct值）阈值周期数（Cycle threshold，Ct值）是qPCR结果分析中最重要的参数之一。
Ct值定义为荧光信号强度达到设定阈值时的PCR循环数。
Ct值越低，说明样品中的目标DNA 含量越高。
2. 商品曲线（Standard curve）商品曲线是一个由已知浓度的标准样品所构建的曲线。
通过检测标准样品的荧光信号强度和浓度之间的关系，可以将未知样品的Ct值与标准曲线进行比较，从而推断出未知样品中目标DNA的浓度。
3. 目标与参考基因的相对表达在一些研究中，我们想要知道目标基因在不同样品中的相对表达水平。
为了实现这一目的，通常会选择一个稳定表达且广泛分布的参考基因。
通过将目标基因与参考基因的Ct值进行比较，可以计算出它们之间的相对表达量。
4. 判定结果的可靠性为了保证实验结果的准确性和可靠性，我们需要注意以下几点： - 重复性：重复进行qPCR实验并比较结果的一致性，可评估实验的稳定性和可重复性。
- 阈值选择：合理选择阈值，通常建议在指数增长阶段的荧光信号取一个固定的数值。
- 负对照：包括未加模板DNA的反应体系，用于验证实验的特异性，即排除潜在的污染或假阳性结果。
如何观察历史荧光定量PCR数据如果我们有一批历史qPCR数据，想要重新分析或比较结果，以下是一些方法和注意事项：1. 比较Ct值首先，我们可以比较不同样品或不同实验之间的Ct值。
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告一、实验目的1、掌握荧光定量PCR技术2、学习如何制备PCR反应体系3、了解实时荧光PCR数据分析4、检测DNA含量二、实验原理荧光定量PCR技术是一种基于PCR扩增原理的DNA分析方法，可定量检测DNA的含量，广泛应用于生物学、医学等领域。
该技术主要依靠荧光标记物，结合荧光信号强度进行定量分析。
PCR反应过程中，引物与模板DNA结合后在酶的催化下形成新的DNA链，每个PCR循环会翻倍模板量。
PCR扩增的温度曲线显示，PCR反应初期呈指数上升阶段，后期呈平台期，最后呈线性上升期。
荧光定量PCR技术基于PCR反应的初期、指数上升阶段的振幅与CT值（Crossing Threshold，荧光信号的阈值值点）之间的关系，对样品中靶序列的含量进行定量分析。
三、实验步骤以10μL体积计算，将荧光定量PCR反应体系制备如下表：试剂名称一次浓度最终浓度10μL体积SYBR Green 1x 1x 1μLdNTPs 10mM 0.2mM 0.2μLMgCl2 25mM 3mM 0.3μLTaq DNA Polymerase 5u/μL 0.04u/μL 0.04μLForward Primer - 0.2μM 0.2μLReverse Primer - 0.2μM 0.2μLTemplate DNA - 1ng-100ng 1μLddH2O - - 7.24μL2、装载PCR板将PCR反应体系均匀装到PCR板中，按照如下步骤进行：① 每组实验会使用96孔PCR板；② 取出PCR板后，先用蒸馏水清洗；③ 按照实验设计，合理地将合适的试剂组合均匀装出到每个孔中；④ 采用专用移液器，能够准确的移液。
3、进行PCR扩增反应在PCR扩增反应期间，我们将执行以下操作：② 进行荧光定量PCR反应；③ 在PCR反应过程中，分别记录下样品的CT值和所测基因的拷贝数；4、数据分析① 利用荧光定量PCR仪进行CT值分析，记录下每个样品的CT值；② 利用以下公式，将CT值成功转化成所测基因的拷贝数：DNA含量（ng）=拷贝数 X DNA分子量/ 6.02 X 10^23;③ 分别计算出每个样品的DNA含量；④ 利用所得数据，绘制出荧光定量PCR的结果图，并进行结果的解释。
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量pcr 实验报告荧光定量PCR 实验报告引言：荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和定量特定DNA序列。
它通过在PCR反应中引入荧光探针，可以实时监测PCR扩增过程中的DNA产物累积情况。
本实验旨在利用荧光定量PCR技术，检测目标基因在不同样本中的表达水平。
材料与方法：1. 样本准备：从不同组织中提取总RNA，并利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
2. PCR反应体系的配制：根据厂家提供的荧光定量PCR试剂盒说明书，配制PCR反应体系。
3. 荧光定量PCR扩增条件：预热酶解反应，然后进行PCR扩增，最后进行荧光信号检测。
4. 数据分析：利用荧光定量PCR仪器提供的软件对实验数据进行分析，计算目标基因的表达量。
结果与讨论：通过荧光定量PCR实验，我们成功检测到目标基因在不同样本中的表达水平。
实验结果显示，在肝脏组织中，目标基因的表达量最高，而在肺组织中表达量最低。
这与已有的研究结果一致，说明我们的实验结果是可靠的。
荧光定量PCR技术的优点在于其高灵敏度和高特异性。
相比传统的定量PCR技术，荧光定量PCR可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而准确测量目标基因的表达量。
此外，荧光定量PCR还可以同时检测多个基因的表达水平，提高实验效率。
然而，荧光定量PCR也存在一些限制。
首先，实验过程中需要使用荧光探针，这增加了实验的复杂性和成本。
此外，荧光定量PCR对样本的质量要求较高，如果样本中存在较多的抑制物质，可能会导致PCR扩增效率降低。
在今后的研究中，我们可以进一步探索荧光定量PCR技术的应用。
例如，可以利用这一技术研究基因表达的调控机制，或者检测特定基因在疾病发展过程中的变化。
此外，我们还可以结合其他分子生物学技术，如RNA测序和蛋白质组学，深入研究基因的功能和调控网络。
结论：荧光定量PCR是一种可靠、高效的分子生物学技术，用于检测目标基因的表达水平。
荧光定量pcr实验原理及数据分析
阈值设定
确定荧光信号与背景噪声的界限， 用于计算Ct值。
标准化处理
消除实验间的差异，使数据具有可 比性。
荧光定量PCR数据质量控制
01Biblioteka 0203重复性检验
检查同一样本不同孔之间 的Ct值差异，确保实验可 重复性。
扩增效率评估
通过标准曲线计算扩增效 率，确保实验的准确性。
熔解曲线分析
检查产物的特异性，避免 非特异性扩增对结果的影 响。
荧光定量PCR技术特点
高灵敏度、高特异性、宽线性范围、可重复性好等。
荧光定量PCR技术分类
根据荧光标记物的不同，可分为探针法和染料法两大类。 探针法包括TaqMan探针法、分子信标法等；染料法包括 SYBR Green I染料法等。
02
荧光定量PCR实验原理
PCR技术基本原理
DNA聚合酶作用
PCR技术利用DNA聚合酶的酶促反应， 以单链DNA为模板，合成与之互补的 双链DNA。
多重荧光定量PCR技术的完善与应用
未来将继续优化多重荧光定量PCR技术，提高检测的准确性和通量，并拓展其在临床诊 断和个性化医疗等领域的应用。
与其他技术的融合与创新
荧光定量PCR技术可以与其他技术如质谱技术、蛋白质组学技术等相结合，实现多组学 数据的整合分析，为生物医学研究提供更全面的信息。
THANKS
酶浓度
酶的浓度直接影响扩增效率，需根据实验需 求进行优化。
dNTP浓度
dNTP浓度过高会导致非特异性扩增，过低 则会影响扩增效率，需进行优化。
反应体积
反应体积的大小会影响扩增效率和荧光信号 的检测，需根据实验需求进行调整。
05
荧光定量PCR技术在生物医 学研究中的应用
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告周向阳
平台期 线性扩增期 指数扩增期
基线期
扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
扩增曲线
S型曲线的四个特征性阶段
➢ 线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。
➢ 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环 后，PCR产物呈指数倍增加。
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
PCR产物的电泳检测和分析
ladder
PCR fragment
二、实时荧光定量PCR
(Real time Quantitative PCR)
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始 浓度进行定量分析的方法。
手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值， 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。
Ct值
• Ct（Cycle Threshhold）值：每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。
目的基因：FAM
内标：HEX
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
➢ 基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均 一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对 每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自 动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其 他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整 分析。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
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对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
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标准曲线分析
斜率、截距、相关性
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
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TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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Setup Instrument Results
Plate Spectra Component Amplification plot Standard Curve Dissociation Report
Spectra （光谱）选项卡显示所选反应孔的荧光光谱。 用鼠标指针点击并拖动 Cycles （循环）滑块上的指示器， 可查看每一循环的光谱。 Cycle（循环数）文本框中显示滑块指示器的当前位置。
常见的荧光染料
FAM
HEX TET JOE TAMRA ROX SYBR® green I
不同荧光染料的纯光谱
基线
Baseline: The initial cycles of PCR during which there is little change in fluorescence signal(usually cycles 3 to 15).
阈值设置太低
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之下。其标准误差远 高于正确设置阈值时图谱的标准误差。向上拖动阈值条， 使之处于扩增曲线的指数增长期内。
阈值设置太高
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之上。其标 准误差远高于正确设置阈值时图谱的标准误差。 向下拖动阈值条，使之处于扩增曲线的指数增 长期内。
手动调整阈值
实验中的对照
NTC(No template controls) Positive control Negative control
不同的反应液对比
产生的△Rn值也不同。
本底荧光信号基线属于非 模板依赖的因素，两种反 应液的基线是不同的。 Ct值的变化并没有反映出 反应体系的总体效果
基线设置太高
扩增曲线从最大基线之前开始。应减小 End Cycle （结束循环）的值。
阈值(Threshold)
对于一个样品，当荧光信号超过阈值可以被检 测到。 通常3～15个循环的荧光信号（基线）的标准 偏差的10倍。 一般软件计算给出，可以手动调整。 指数期 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值
Component （成分）选项卡 显示整个 PCR 运行期间所选反应孔的每种荧 光的完整光谱表现。每次只能显示第一个选取 的反应孔。
Rn vs. Cycle (Linear) （Rn 随循环变 化，线性）
ΔRn vs. Cycle (Log) （ΔRn 随循环变 化，对数）视图
曲线分析
荧光PCR结果分析
Kary Mullis
PCR及有关技术的发展历史
1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这 年底（12月16日第一次成功实验）发明了 PCR。 “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷 贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路 上时想出来的”。
TaqMan-5’ Nuclease Assay
TaqMan名字的由来 从一个游戏PacMan (Namco) Pac-Man是一款80年 代经典吃豆游戏
PCR扩增分四个区
开关机顺序
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪 器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。 开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再 开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯 亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实 验。 关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭 信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的 电源，最后关闭电脑。
Typically 1-2 cycles beforethe reporter dye signal begins to increase.
基线设置正确
扩增曲线从最大基线之后开始。不需要进行调整。
基线设置太低
扩增曲线从远离最大基线的右侧位置开始。 应增大 End Cycle （结束循环）的值。
灵敏度相当的反应液产生 的Ct绝对值可能不同。
标准曲线
Standard curve: Obtained by plotting Ct values against log-transformed concentrations of serial ten-fold dilutions of the target nucleic acid.
Ct值(threshold cycle)
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的扩增循环次数
与加入样品拷贝数的对数成线形关系 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。
阈值设置正确
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之内。 高于或低于最优化值的阈值设置将会增大重复组的标 准偏差。
PCR只是一个简单的不起眼玩艺 PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR 概念变成了可操作的实验系统，变成了一项 成熟的技术。 它最大的特点就是能不断推出新形式。
实时荧光PCR技术发展历程
1991年Cetus公司的Holland等在Proc Natl Acad Sci U S A 上发表了TaqMan® probes 技术。 1993年美国Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer 的Lee 等在Nucleic Acids Research杂志上发表了使用双荧光标记的实时 荧光PCR方法。 1996年美国纽约公共卫生研究所(Public Health Research Institute) Tyagi和 Kramer在Nat Biotechnol上发表了分子信标 (Molecular beacons)方法。
总结
检测 基线 阈值 NTC 对照 样品
谢谢！