荧光PCR结果分析
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线,按照标准曲线计算。
一般都就是相对量。
则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。
举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。
实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。
ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。
２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。
2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。
但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。
必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。
2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。
最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
定性和定量测定结果报告上的混淆。
为什么要做定量测定？
用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果 的动态观察及抗病毒药物的临床研究； 用于基因表达方面的研究，如特定的 mRNA的定量测定。
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
定量和定性测定的结果报告
报告中所应具备的信息
标题，例如“检测报告” 报告的唯一性标识（如序号） 检测标本的特性和状态 检测标本的接收时间和进行检测的时间 采用的检测方法 实验操作及校核人员的签字，以及签发日期 检测报告中应给出参考结果或范围
谢谢！
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。 定性测定结果报告:报告“阳性”或“阴性”, “检出” 或“未检出”, “反应”或“未反应”
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。 参比（Reference） 用于对检测结果进行标准 化的被动（Passive）或主动（Active）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
荧光测定pcr实验报告
荧光测定pcr实验报告引言聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增DNA 目标序列。
PCR扩增过程中，荧光标记的探针可以用来监测DNA模板的定量。
本实验旨在通过荧光测定PCR的方法，对指定DNA序列进行定量分析。
实验设计与方法实验设计1. 收集样本：收集待测DNA样本。
2. 准备试剂：准备PCR反应体系所需的试剂，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等。
3. 试剂配置：按照实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液。
4. PCR反应：根据实验设计，进行PCR反应，在PCR仪中设置加热曲线。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，通过荧光实时监测相应信号。
实验方法1. 收集样本：收集待测DNA样本，保证样本的纯度和完整性。
2. 准备PCR反应体系：按照实验设计，配置PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等，保证试剂的浓度和质量。
3. 试剂配置：根据实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液，保证试剂的稳定性和反应效果。
4. PCR反应：将待测DNA样本和试剂混合，在PCR管中进行适当的温度变化，进行PCR反应。
PCR反应的参数包括初始变性、循环变性、退火、延伸等步骤。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，监测PCR反应产生的荧光信号。
通过荧光实时监测，可以定量分析PCR扩增的产物。
结果与分析荧光测定PCR结果在本实验中，通过荧光测定PCR的方法成功扩增了目标DNA序列。
在PCR反应过程中，实时监测到荧光信号的增强，表明DNA扩增的过程正常进行。
荧光信号定量分析结果通过荧光信号的实时监测，可以进行PCR扩增产物的定量分析。
扩增产物的荧光信号强度与初始模板DNA的浓度成正比，因此可以通过荧光信号的强度来估计初始模板的浓度。
数据处理与统计分析对实验得到的数据进行处理和统计分析，可以得到PCR扩增产物的浓度。
通过与标准曲线的比较，可以确定PCR产物的浓度。
结论本实验成功使用荧光测定PCR的方法扩增了目标DNA序列，并进行了定量分析。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR数据分析
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量pcr检测报告怎么看
荧光定量pcr检测报告怎么看荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性、快速、准确的分子生物学检测方法。
它广泛应用于疾病诊断、药物研究和生物学研究等领域。
在进行PCR检测后，我们需要仔细阅读PCR检测结果所得到的荧光定量PCR检测报告。
但是，对许多人来说，阅读PCR检测报告是一件比较困难的事情。
因此，本文将介绍荧光定量PCR检测报告的几个主要部分及其含义，希望能够对各位有所帮助。
荧光定量PCR检测报告通常由以下几个部分组成：1. 标本信息：包括检测样本的类型、编号、采集时间等信息。
2. 检测结果：主要包括所检测的目标基因、荧光定量PCR检测值、检测下限、灵敏度等参数。
3. 样本质控：主要包括PCR扩增曲线、熔解曲线、负轨迹、标准曲线等信息。
4. 结论：根据所检测的目标基因的荧光定量PCR检测值和检测下限，判断样本是否为阳性或阴性。
那么，如何读取荧光定量PCR检测报告呢？一般来说，读取荧光定量PCR检测报告需要注意以下几个方面：1. 检测结果：在检测结果部分，会显示所检测的目标基因的荧光定量PCR检测值。
如果荧光定量PCR检测值大于检测下限，则判断为阳性；如果荧光定量PCR检测值小于检测下限，则判断为阴性。
2. 样本质控：在样本质控部分，将显示PCR扩增曲线、熔解曲线、负轨迹和标准曲线等信息。
通过样本质控部分的信息，可以确定荧光定量PCR检测结果的准确性和可靠性。
3. 结论：根据检测结果和样本质控，得出检测样本的阳性或阴性结论。
如果样本为阳性，则需要进一步进行确认检测和治疗；如果样本为阴性，则可以排除所检测的疾病。
总之，阅读荧光定量PCR检测报告需要认真严谨，对于未知词汇和专业名词需要有一定的了解，以便准确判断检测结果和结论。
希望本文能够帮助大家更好地理解和读取PCR检测报告。
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Setup Instrument Results
Plate Spectra Component Amplification plot Standard Curve Dissociation Report
Spectra （光谱）选项卡显示所选反应孔的荧光光谱。 用鼠标指针点击并拖动 Cycles （循环）滑块上的指示器， 可查看每一循环的光谱。 Cycle（循环数）文本框中显示滑块指示器的当前位置。
常见的荧光染料
FAM
HEX TET JOE TAMRA ROX SYBR® green I
不同荧光染料的纯光谱
基线
Baseline: The initial cycles of PCR during which there is little change in fluorescence signal(usually cycles 3 to 15).
阈值设置太低
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之下。其标准误差远 高于正确设置阈值时图谱的标准误差。向上拖动阈值条， 使之处于扩增曲线的指数增长期内。
阈值设置太高
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之上。其标 准误差远高于正确设置阈值时图谱的标准误差。 向下拖动阈值条，使之处于扩增曲线的指数增 长期内。
手动调整阈值
实验中的对照
NTC(No template controls) Positive control Negative control
不同的反应液对比
产生的△Rn值也不同。
本底荧光信号基线属于非 模板依赖的因素，两种反 应液的基线是不同的。 Ct值的变化并没有反映出 反应体系的总体效果
基线设置太高
扩增曲线从最大基线之前开始。应减小 End Cycle （结束循环）的值。
阈值(Threshold)
对于一个样品，当荧光信号超过阈值可以被检 测到。 通常3～15个循环的荧光信号（基线）的标准 偏差的10倍。 一般软件计算给出，可以手动调整。 指数期 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值
Component （成分）选项卡 显示整个 PCR 运行期间所选反应孔的每种荧 光的完整光谱表现。每次只能显示第一个选取 的反应孔。
Rn vs. Cycle (Linear) （Rn 随循环变 化，线性）
ΔRn vs. Cycle (Log) （ΔRn 随循环变 化，对数）视图
曲线分析
荧光PCR结果分析
Kary Mullis
PCR及有关技术的发展历史
1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这 年底（12月16日第一次成功实验）发明了 PCR。 “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷 贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路 上时想出来的”。
TaqMan-5’ Nuclease Assay
TaqMan名字的由来 从一个游戏PacMan (Namco) Pac-Man是一款80年 代经典吃豆游戏
PCR扩增分四个区
开关机顺序
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪 器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。 开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再 开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯 亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实 验。 关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭 信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的 电源，最后关闭电脑。
Typically 1-2 cycles beforethe reporter dye signal begins to increase.
基线设置正确
扩增曲线从最大基线之后开始。不需要进行调整。
基线设置太低
扩增曲线从远离最大基线的右侧位置开始。 应增大 End Cycle （结束循环）的值。
灵敏度相当的反应液产生 的Ct绝对值可能不同。
标准曲线
Standard curve: Obtained by plotting Ct values against log-transformed concentrations of serial ten-fold dilutions of the target nucleic acid.
Ct值(threshold cycle)
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设 定的阈值时所经过的扩增循环次数
与加入样品拷贝数的对数成线形关系 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。
阈值设置正确
阈值设置在扩增曲线的指数增长期之内。 高于或低于最优化值的阈值设置将会增大重复组的标 准偏差。
PCR只是一个简单的不起眼玩艺 PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR 概念变成了可操作的实验系统，变成了一项 成熟的技术。 它最大的特点就是能不断推出新形式。
实时荧光PCR技术发展历程
1991年Cetus公司的Holland等在Proc Natl Acad Sci U S A 上发表了TaqMan® probes 技术。 1993年美国Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer 的Lee 等在Nucleic Acids Research杂志上发表了使用双荧光标记的实时 荧光PCR方法。 1996年美国纽约公共卫生研究所(Public Health Research Institute) Tyagi和 Kramer在Nat Biotechnol上发表了分子信标 (Molecular beacons)方法。
总结
检测 基线 阈值 NTC 对照 样品
谢谢！