PCR引物设计与测序结果分析
实验五 PCR引物设计及评价
实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
pcr技术扩增DNA实验报告
pcr技术扩增DNA实验报告摘要：PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，通过该技术可以在短时间内获得大量特定DNA序列的复制。
本实验旨在使用PCR技术对DNA进行扩增，验证其可行性和准确性。
实验结果表明，PCR技术成功扩增了目标DNA，并呈现出预期的结果。
引言：PCR技术的发明对分子生物学领域做出了巨大贡献。
PCR通过扩增DNA片段来满足各种实验和应用的需求，例如基因克隆、遗传突变检测和DNA起源研究等。
PCR技术的原理基于DNA链的反应性，在特定条件下通过DNA引物、酶和核苷酸扩增目标DNA序列。
本实验旨在验证PCR技术的可行性和准确性，并展示扩增DNA的结果。
材料与方法：材料：1. DNA模板：提供待扩增的DNA样本。
2. 引物：设计用于识别并扩增目标DNA序列的引物。
3. PCR反应液：包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、镁离子。
4. PCR仪：用于控制PCR反应的温度和时间。
方法：1. 准备PCR反应液：按照指定比例将缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、镁离子混合制备PCR反应液。
2. 加入DNA模板和引物：将待扩增的DNA模板和引物加入PCR反应液中。
3. PCR反应条件设置：根据扩增目标和引物的特性设置PCR反应的温度和时间。
4. PCR反应进行：将PCR反应管放入PCR仪中，进行PCR反应。
5. 扩增产物分析：将PCR反应的产物进行凝胶电泳分析。
结果：经过PCR反应后，我们成功扩增了目标DNA序列，并获得了预期的结果。
凝胶电泳分析显示PCR扩增产物呈现出目标大小的DNA条带，并且PCR扩增产物的浓度较高。
讨论：PCR技术的成功扩增显示了其在分子生物学领域的重要性和应用价值。
通过PCR技术，我们可以在保证准确性和快速性的前提下，生成大量特定DNA序列。
在本实验中，我们通过PCR技术扩增了目标DNA，证明了PCR技术在实验中的可行性和准确性。
此外，本实验还展示了PCR反应条件对扩增结果的重要影响。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的DNA分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增DNA片段，是许多分子生物学实验的基础。
PCR测序是利用PCR技术对DNA片段进行扩增，并通过测序方法确定DNA序列的过程。
本文将重点介绍PCR测序的原理及其在实验中的应用。
首先，PCR测序需要进行PCR扩增反应。
PCR扩增是通过DNA聚合酶酶和引物（primers）的作用，在一定的温度条件下，对DNA片段进行多轮扩增的过程。
在PCR扩增反应中，引物将与目标DNA序列特异性结合，DNA聚合酶酶则在引物的引导下合成新的DNA链。
经过多轮循环，目标DNA片段将得到显著的扩增。
在PCR扩增反应完成后，接下来就是进行测序。
PCR测序主要有Sanger测序和Next Generation Sequencing（NGS）两种方法。
Sanger测序是第一代测序技术，它利用特殊的二进制缺失核苷酸，将DNA合成链随机终止，从而得到DNA序列信息。
而NGS则是一种高通量测序技术，能够同时对大量的DNA片段进行测序，大大提高了测序的效率。
在Sanger测序中，PCR扩增得到的DNA片段将被用作测序模板。
首先，将DNA片段与引物和特殊的二进制缺失核苷酸一起进行反应，DNA聚合酶将在缺失核苷酸的位置停止合成新的DNA链。
通过对反应产物进行电泳分离，就可以确定DNA序列信息。
而在NGS中，PCR扩增得到的DNA片段将被连接到芯片或固相支持上，形成文库。
接下来，通过特定的测序仪器对文库中的DNA片段进行测序，从而得到大量的DNA序列信息。
总的来说，PCR测序是一种快速、准确的DNA测序方法，广泛应用于基因组学、疾病诊断、药物研发等领域。
通过PCR扩增和测序技术，我们可以快速获取目标DNA片段的序列信息，为科研和临床实践提供了重要的技术支持。
在实验中，PCR测序需要严格控制反应条件和引物设计，以确保扩增和测序的准确性。
miRNA常用实验方法
miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。
通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。
因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。
一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。
2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。
因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。
我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。
实验二PCR引物设计
5. 上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物 的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形 成引物二聚体。
6. 3’末端 • 3’末端的性质非常关键。 • 不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的
引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生； • 5’端序列添加限制性酶切位点。
二、Primer Premier 软件设计引物
• 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的 软件
• 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、 primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif
பைடு நூலகம்
正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及 反向互补（reverse complemented ）。
E值越小为好！！
缺失或插入，用“-”来表 示
Query1、2表示输入 的两对引物，Sbjct表 示在库里比对的序列
Degeneracy多义性，尽量减少
GC% 含量：对于 引物多义性，这样会带来更好
PCR 反应来说 GC 的特异性，尽量避免3’末端
含量在50% 左右比 的多义性，因为这个位置即使
较合适。
一个碱基的错配都能阻止引物
（40-60%,45-55%） 延伸。
三、ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物
• 在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： • 例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
• 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’ → 3’。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
PCR技术及测序解析
SOLiD测序示意图
Helico BioScience
该测序是基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段 并用末端转移酶在 3' 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端进行荧光标 记和阻断，把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交 模板所处的位置，建立边合成边测序的位点 加入聚合酶和被Cy3荧光标 记脱氧核苷酸进行DNA 合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未 参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观测模板位点 上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放。加入下一种 脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮id的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR， 但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端 进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。 在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。 3.连接酶测序：Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为： 3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。 探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种 类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基 确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。 当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号， 图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录 下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号， 以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都 相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链 变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头 配对的位置上相差一个碱基（图6-a. 8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序 位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成， 依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均 被检测了两次。
pcr的原理及应用实验报告总结
PCR的原理及应用实验报告总结引言聚合酶链反应（PCR）是一种在生物学实验中广泛使用的技术，可以扩增特定DNA 序列。
本实验报告总结了PCR的原理和应用。
原理PCR利用了DNA的双链结构和DNA聚合酶的催化活性。
它通过反复进行一系列温度变化的循环，以在每个循环中将DNA的目标区域复制数百万次。
PCR的原理主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：在高温下（通常为94-98°C），通过打破DNA的双链结构，使其变成两条单链DNA。
这是通过提供足够的热能来克服DNA的氢键和茎-环结构来实现的。
2.退火（Annealing）：在较低温度（通常为50-65°C），引入一组匹配目标序列的两个DNA引物。
这些引物是短DNA片段，其序列与需要扩增的目标序列的两端相互补充。
引物结合到DNA上，形成稳定的引物-目标复合物。
3.延伸（Extension）：在适宜的温度（通常为68-72°C），DNA聚合酶开始在目标序列的引物上合成新的DNA链。
这意味着引物作为DNA聚合酶的起始点，延伸形成一条新的DNA链。
通过多次循环这个过程，从而可以扩增DNA的目标区域，从而得到大量的特定DNA序列。
应用PCR技术在许多生物学领域中都有广泛的应用。
下面介绍PCR在基因分型、病原体检测和基因工程等方面的应用。
基因分型PCR可以用于基因分型，例如DNA指纹图谱的生成和遗传病等基因突变的检测。
通过扩增特定的基因区域，可以获得个体之间的DNA差异，以区分个体之间的遗传差异。
病原体检测PCR可以用于病原体的快速检测。
通过扩增特定的病原体DNA或RNA序列，PCR 可以确定患者是否感染了病原体。
此外，PCR还可以在医学实验室中用于鉴定和检测病原体的抗药性。
基因工程PCR在基因工程中有重要的应用。
PCR可以扩增特定的基因片段，从而提供了DNA 重组的材料。
这些扩增片段可以用于构建基因表达载体、制备基因库以及进行定点突变等。
PCR、引物设计及逆转录PCR解析
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的R仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
引物设计的基本原则
• PCR（Polymerase Chain Reaction) 技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外 扩增技术。
• 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学 奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、
cDNA，也可以使细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的
特异性；确定扩增产物长度。
➢DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动
PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。
➢缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离
因此仅mRNA可被逆转录。
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以 引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃， 30 ～ 60s ）。
测序引物设计指南
测序引物设计指南♦PCR引物设计方法：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
测序常见问题及其分析
图2
解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）
测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化
2、克隆测序时出现峰形重叠
原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染
解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液。
pcr出科自我鉴定
pcr出科自我鉴定PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因组学、医学诊断以及法医鉴定等领域。
作为PCR出科者，我们需要自我鉴定的过程，以确保我们具备必要的技能和知识来正确地进行PCR实验操作，并准确解读实验结果。
以下是我自我鉴定的内容：一、PCR原理与实验步骤在实施PCR实验前，我们首先要了解PCR的原理。
PCR基于酶的催化作用，通过不断的循环反应，在体外合成大量特定DNA片段。
PCR反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在PCR实验中，我们需要准确配制反应液、合理选择引物、确定退火温度和时间，并进行适当的控制实验条件，确保PCR反应的可重复性和准确性。
二、PCR引物设计与文献查阅在PCR实验中，合理的引物设计是成功实验的关键之一。
我们需要能够根据目标基因序列设计引物，并考虑引物的碱基对性、Tm值和特异性等因素。
在实施PCR实验前，我们需要通过文献查阅，了解目标基因的序列信息，并借助生物信息学工具进行引物设计和特异性分析。
三、PCR实验操作技巧PCR实验的操作过程需要一定的技巧，以确保实验结果的准确性和可重复性。
在实验操作中，我们需要保证实验室的清洁卫生，避免污染引物和试剂。
此外，准确量取试剂和样品、严格控制实验时间和温度、合理选择PCR仪的程序和参数等都是我们需要注意的事项。
四、PCR实验结果分析与解读PCR实验结果的分析与解读是PCR出科者应具备的核心能力之一。
我们需要能够分辨PCR扩增产物的大小和特异性，并通过凝胶电泳等方法进行分析。
此外，对PCR实验结果的异常情况，如非特异性扩增、阳性对照和阴性对照结果等，我们也需要学会解读和排除可能的干扰因素。
五、PCR实验质量控制PCR实验中的质量控制至关重要，它可以减少实验误差和提高结果的可靠性。
我们需要对实验中的试剂进行检测和验证，并进行阳性对照和阴性对照实验，以确保实验的可靠性。
此外，合理选择实验样本和控制组，并进行重复实验和统计分析，都是为了控制PCR实验的质量。
PCR实验及结果分析
PCR技术简介
• PCR常见问题： 一.出现假阴性； 二.出现假阳性； 三.出现非特异性扩增带； 四.出现片状拖带或涂抹带。
PCR技术简介
一.PCR出现假阴性原因：
1．模板因素： 2．酶失活： 3．引物： 4．Mg2+浓度： 5．反应体积的改变： 6．物理原因： 7．靶序列变异：
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 模板因素：
（1）模板中含有杂蛋白； （2）模板中含有Taq酶抑制剂； （3）模板中蛋白质残留，
特别是染色体中的组蛋 白残留； （4）提取制备模板时丢失过多； （5）模板核酸变性不彻底。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某 个区域而进行的重复双向DNA合成。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是
需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引
物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例， 在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是 从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 引物引起假阴性解决方案:
1.选定一个好的引物合成单位; 2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔
浓度；
3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长 期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要 求合成单位将固体分装；
PCR引物设计技巧
PCR引物设计知识与技巧分析点击次数：309 发布时间：2010-7-19PCR引物设计知识与技巧分析自从1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCP) 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。
然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。
现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。
1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。
但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。
因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。
所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。
下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。
①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。
特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。
④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol。
针对外显子设计PCR测序引物教程
针对外显子设计PCR测序引物教程外显子是基因组中编码蛋白质的区域，研究外显子可以帮助我们理解基因的功能和相关疾病的发生机制。
PCR测序引物是进行PCR扩增和测序的关键组分，合理的引物设计可以提高PCR测序的准确性和可靠性。
本教程将介绍如何针对外显子设计PCR测序引物。
一、引物设计原则1.引物长度：一般而言，引物的长度应在18-30个碱基对之间，太短会导致非特异性扩增，太长则会影响扩增效率。
2.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在52-58℃之间，以确保引物在PCR反应中的稳定性。
3.引物互补性：引物之间以及引物与模板DNA的互补性应避免或最小化，以防止非特异性扩增。
4.引物特异性：引物应特异性地结合到目标外显子区域，而不结合到其他区域。
可以通过BLAST等工具对引物进行序列比对，确保引物的特异性。
5.引物GC含量和GC均匀性：引物的GC含量应在40-60%之间，同时引物的GC均匀性也应较好。
GC含量过高或过低会影响PCR反应的效率。
二、引物设计步骤2. 引物定位：根据目标外显子序列，确定引物的起始位置和结束位置。
一般而言，引物应位于外显子的边界处，以确保扩增目标外显子。
同时，可使用软件工具（如ExonPrimer、Primer3等）进行自动引物定位。
3.引物设计：根据引物设计原则，设计一对特异性引物。
通常，外显子扩增需要一对引物，即前向引物和反向引物。
前向引物应与目标外显子的正链序列互补，反向引物则应与目标外显子的负链序列互补。
4. 引物评价：使用引物评价工具（如OligoAnalyzer等）评估引物的物理性质，如Tm值、互补性和自身形成二聚体等。
并根据评价结果对引物进行优化调整，确保引物质量。
5.引物合成：将引物序列提交给合成引物的机构进行合成。
三、实验操作注意事项1.引物浓度：引物的最佳浓度应在10-50uM之间。
过高或过低的引物浓度都会影响PCR反应的效率。
2.引物储存：琼脂糖电泳检测双峰带应将引物储存在-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
PCR引物设计方法和原理
实验试错法是一种相对原始的引物设计方法，通过实验尝试和调整来找到最佳的引物序列。该方法适用于实验条 件不明确或缺乏先验知识的情况，通过反复实验和调整来获得最佳的引物组合。虽然实验试错法效率较低，但对 于探索新领域和未知情况具有一定的价值。
04 pcr引物设计的原理
引物的特异性原理
引物的特异性原理是指引物与模板DNA的结合具有严格的特 异性和专一性。在PCR扩增过程中，引物与模板DNA的结合 位点是特定的，只有当引物的序列与模板DNA完全互补时， 引物才能与模板结合，进行有效的扩增。
为确保引物的特异性，通常要求引物在3'端具有18-20个与模 板DNA互补的序列，以形成稳定的氢键，同时要求引物之间 不存在互补性，以避免形成引物二聚体。
引物的长度和浓度原理
引物的长度和浓度是影响PCR扩增的重要因素。引物的长 度通常在18-30个核苷酸之间，过短可能无法有效结合模 板，过长则可能导致结合不稳定。
引物的浓度也需进行优化，过高可能导致非特异性结合，过 低则可能影响扩增效率。根据经验，一般将引物浓度设定在 0.1-0.5μM之间，具体浓度根据引物的长度和序列特性进行 适当调整。
引物的温度和平衡原理
引物的温度和平衡原理是指在PCR扩增过程中，需要选择合适的温度使引物与模板DNA结合，并保持引物与模板之间的平衡 状态。
详细描述
计算机辅助设计法利用专业的引物设计软件，根据输入的目标序列和实验条件，自动筛 选出符合要求的引物序列。该方法能够大大提高引物设计的效率和准确性，减少人工误
差和实验时间。常用的引物设计软件包括Primer3、Oligo等。
实验试错法
总结词
通过实验尝试和调整来找到最佳引物的方法，适用于未知情况和新领域。
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延伸
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
72˚C
PCR出现的问题：
引物是否合 适?
➢ PCR扩增未得到目的条带？
➢ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性 ）？
➢ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环
PCR结果析
引物二聚体
发夹结构
7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基 ，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位 点5’端加上适当数量的保护碱基）。
Northern Blot
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
预变性
94oC 5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
变性
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
94˚C
退火
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。
正义链
反义链
基本分子生物学研究手段
PCR PCR反应液体的成分:
PCR循环的程序: PCR原理：
基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
基本分子生物学研究手段
PCR引物设计及测序结 果分析
Content
聚合酶链式反应（PCR） 的技术 原理及结果分析
PCR引物设计原理及相关软件的使 用（ Primer Premier 5.0 ）
测序结果分析
一 . PCR的技术原理及结果分析
❖ 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 ，故又称为基因的体外扩增法。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突 变检测的敏感性。
二. PCR引物设计原理及相关软件的使用 （ Primer Premier 5.0 ）
❖ 引物 ❖ 引物的重要性 ❖ 引物设计的原则 ❖ 引物同源性分析 ❖ 引物设计软件 ❖ 如何使用Primer Premier 5.0 ❖ 酶切位点及保护碱基的添加
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上 下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。
4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位， 且最好不选择A
5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹 结构；引物自身不能配对，否则易形成约 两个引物长度的引物二聚体；
基本原则：
➢ 引物与模板的序列要紧密互补 ➢ 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 ➢ 引物不能在模板的非目的位点引发DNA
聚合反应(即错配)。
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
❖ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃）
❖ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
➢ 各种试剂先进行分装，低温贮存。 ➢ 设置阳性和阴性对照，重复实验
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低 ，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中， 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检 测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
引物（primers)
❖ 引物是人工合成的两段寡 核苷酸序列，一个引物与 感兴趣区域一端的一条 DNA模板链互补，另一个 引物与感兴趣区域另一端 的另一条DNA模板链互补 。(上游引物与DNA序列一 致,下游引物要反相互补.)
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
➢ 模板不纯或降解 ➢ Buffer不合适 ➢ 退火温度偏低 ➢ 酶量过多 ➢ dNTP、Mg2+浓度偏高 ➢ 循环次数过多
M12
产物在凝胶上呈Smear状态
4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策
➢ 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外；
➢ 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。
PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）
PCR常见问题
1. 无扩增产物
➢ 模板:含有抑制物，含量低 ➢ Buffer对样品不合适 ➢ 引物设计不当或者发生降解 ➢ 退火温度太高
2. 非特异性扩增
➢ 引物特异性差 ➢ 模板或引物浓度过高 ➢ 酶量过多 ➢ 退火温度偏低 ➢ 循环次数过多
3. 拖尾
引物的重要性
❖ 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
引物设计原则
❖ 引物长度 ❖ 碱基分布的均衡性 ❖ Tm值 ❖ 引物二级结构 ❖ 引物3’端 ❖ 引物5’端 ❖ 引物的内部稳定性 ❖ 引物的保守性与特异性 ❖ 扩增区域的二级结构