PCR实验及结果分析

PCR技术简介
• PCR常见问题： 一.出现假阴性； 二.出现假阳性； 三.出现非特异性扩增带； 四.出现片状拖带或涂抹带。
PCR技术简介
一.PCR出现假阴性原因：
1．模板因素： 2．酶失活： 3．引物： 4．Mg2+浓度： 5．反应体积的改变： 6．物理原因： 7．靶序列变异：
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
3.必要时，加样本前，反应管及试剂用 紫外线照射，以破坏存在的核酸。
PCR出现假阳性原因分析及解决 方案
• 空气中的小片断核酸污染：
这些小片断比靶序列短，但有一 定同源性，可互相拼接，与引物互补 后，扩增出PCR产物，导致假阳性出 现。
• 解决方案：
运用巢式PCR来减轻或消除。
PCR技术简介
三.出现非特异扩增带原因：
1.减少酶量或调换另一来源的酶； 2.减少dNTP浓度； 3.适当降低Mg2+浓度； 4.增加模板量，减少循环次数。
2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。
• 解决方案：
选择特异性强的区段设计引物。
PCR出现假阳性原因分析及解决 方案
• 整个基因组或大片段的污染的解决方 案：
1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入 加样枪内或溅出离心管污染环境。
2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗 材均应高温高压消毒，所用离心管及 枪头均应一次性使用。
1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚 合形成二聚体；
2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR 循环次数过多；
3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。
PCR技术简介
• PCR出现非特异扩增带解决方案： 1.必要时重新设计合成引物； 2.减低酶量或调换另一来源的酶； 3.降低引物量，适当增加模板量，减小
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌－嗜热水 生菌种提纯出来的，经95℃持续温育仍有活性， 不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新 加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在 更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减 少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
5
• 反应条件 • 94℃2-5分钟 • 94 ℃ 40sec • 57 ℃ 40sec • 72℃ 1min 30sec • 72 ℃ 10min
30-35cycle
电泳缓冲液的配制
• 50×TAE Buffer 配制方法：
1 称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2 向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；
片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍 数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需 要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR技术简介
PCR反应所用酶：
早期的PCR方法采用大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反 应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活， 所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并且 在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有 一些错配，导致产物大小不均一。
2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将 退火温度设为45℃ ，然后再逐次提高（以 2℃ /次为宜）。
3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可 适当延长，特别是末次循环，一定要延伸 10min。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 靶序列变异：
靶序列变异导致假引性的情况常 常发生在靶序列变异正好发生于特异 性引物与之结合部的中间，使引物失 效。
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶
不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加 Taq酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR技术及其应用
目录
PCR技术历史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
• 模板因素：
（1）模板中含有杂蛋白； （2）模板中含有Taq酶抑制剂； （3）模板中蛋白质残留，
特别是染色体中的组蛋 白残留； （4）提取制备模板时丢失过多； （5）模板核酸变性不彻底。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条 引物之间形成二聚体等。

PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• Mg2+浓度：
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大， 浓度过高可降低PCR扩增的特异性； 浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• Mg2+浓度引起假阴性解决方案：
设置一组反应，其中每一反应 中的其他离子浓度相同（如 Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不 同（由0.5~6mmol/L,每次增加 0.5mmol/L)，由此来摸索最佳 Mg2+浓度。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 反应体积的改变：
做小体积PCR后，再做大体积时， 一定要重新摸索条件，而非简单地将 反应体系中的各个成分加大几倍，否 则易失败。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 引物引起假阴性解决方案:
1.选定一个好的引物合成单位; 2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔
浓度；
3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长 期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要 求合成单位将固体分装；
简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某 个区域而进行的重复双向DNA合成。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是
需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引
物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例， 在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是 从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，
4。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温 保存。
使用时稀释50倍 即1×TAE Buffer 1.5%
电泳
按照5份PCR产物与一份 6×loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加 入胶中，其中一孔加一份Marker对照，电 泳，电压120，电泳半个小时，放入EB染 色液中，染色半个小时，。
PCR出现假阴性原因分析及解决 方案
• 物理原因：
1.变性温度低，变性时间短； 2.退火温度过高，影响引物与模板的结
合而降低PCR扩增效率； 3.延伸时间过短等。
PCR出现假阴性原因分析及解决
方案
• 物理原因引起假阴性解决方案：
1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首 次循环，必要时可设为95℃ ，10min，或 PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。
循环次数； 4.适当提高退火温度或采用二温度点法
（94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸）。
PCR技术简介
• PCR出现片状拖带或涂抹带原因：
1.酶量过多或酶的质量差； 2.dNTP浓度过高； 3. Mg2+浓度过高,退火温度过低; 4.循环次数过多。
PCR技术简介
• PCR出现片状拖带或涂抹带解决方 案:
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪