免疫细胞的分离与检测解析

MHC I类(左)和Ⅱ类(右)分子四聚体结构示意图
三、细胞的冻存与复苏
1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直
接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶， 引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。 在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细 胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体
二、免疫细胞膜分子的主要检测方法
1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法
2、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 3、花环形成试验
SmIg的荧光抗体检测法
SmIg的酶免疫检测法
染料
补体
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
❖ 吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶 SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘 滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行， 对细胞极少损害。
3、荧光激活分离法（FACS）
流式细胞仪
4、磁性分离法
（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在
E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体
花环形成细胞
B细胞
绵羊红细胞 T细胞
EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的
Fc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B 淋巴细胞周围粘附有红细胞
EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的
红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B 淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。
N
S
MACS (阳性选择法）
N
S
MACS (阴性选择法）
5、其他分离法
花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红
细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液 分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细 胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围 绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物
的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达 到可直接特异性检测t细胞的目的。 作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异 性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。 用于过继性肿瘤免疫治疗 用于疫苗疗效的监测
抗原肽-MHC分子四聚体技术
单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱 内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁 铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。
（2）磁激活细胞分离术MACs：是一种特异性细
胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。 主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。 MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微 粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中， 可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的 细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。 分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。
称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型， 以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程 度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活 化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和 CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实 验模型。
1、密度梯度离心法
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为 400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不 穿过生物膜。 红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单 核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液 的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液 液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
第一节 免疫细胞的分类与分离
一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏
一、免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性
2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
吞噬溶酶体
NK cells
二、免疫细胞的分离技术
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法 5、其他分离法
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稀释抗凝血
血浆
淋巴细胞分离液 离心前
单个核细胞
粒细胞 红细胞 离心后
2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离
贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平
皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和 粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋 巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B 细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离
❖ 尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、 单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则 通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。 T细胞得率为2030%左右。
❖ 亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细 胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞 悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未 吸附的细胞悬液中获取。
2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，
使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长， 活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们 对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
细胞冻存罐
第二节 免疫细胞膜分子的检测
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法
第三节 免疫细胞功能测定
一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验
一、转化、增殖试验
1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植
物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检 测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。
2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或