免疫细胞分离与功能检测
免疫细胞标志与功能检测技术优选文档专选课件
要为（ D ） A 单核细胞和粒细胞 B 单核细胞
C 淋巴细胞 D 淋巴细胞和单核细胞
E 淋巴细胞和粒细胞
5.Percoll分离液的主要成分是E( )
A．聚蔗糖
B．泛影葡胺 C．聚乙二醇
D．聚乙烯吡咯烷酮 E．经聚乙烯吡咯烷酮处
理的硅胶颗粒
6.分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为( E ) A.1.030 B.1.035 C.1.092 D.1.020
泛影葡胺比重为1.077±0.002
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掌握
聚蔗糖泛影葡胺--Ficoll分离液
原理：单次差速密度梯度离心的分离法 组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%
泛影葡胺生理盐水溶液。 比重：1.077±0.001(最佳)
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1.077±0.001的分层液可将细胞分离
红细胞：1.093 粒细胞：1.092 单个核细胞1.0齐7齐6哈—尔医1.学0院9免0疫
全自动细胞分选系统
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荧光激活细胞分离仪分离法
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流式细胞分析仪
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四、不同细胞分离方法的综合评价
了解
早期：根据不同免疫细胞的物理属性和 生物学属性进行分离 近期：利用细胞表面标志进行分离
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1.分离外周血单个核细胞，单次差速密度梯度离 心法常
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Percoll：经聚乙烯吡咯烷酮（PVP)处理的硅胶颗粒。
死细胞、血小板 单核细胞 淋巴细胞
粒细胞 红细胞
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三、T、B细胞和T细胞亚群 熟悉
的分离
磁珠
高分子
(一)磁性微球分离法
免疫细胞制备
免疫细胞制备
免疫细胞的制备主要包括以下几个步骤：
1. 免疫细胞的来源：免疫细胞可以从多个来源获得，常见的包括外周血、骨髓和脐血等。
2. 免疫细胞的分离：从血液或其他组织中分离出免疫细胞。
分离过程可以使用离心机将血液中的不同成分分离，也可以通过过滤、离心和密度梯度离心等方法从组织中提取免疫细胞。
3. 免疫细胞的激活：为了使免疫细胞更具活性，可以使用不同的激活方法，如使用抗体、细胞因子或抗原等。
4. 免疫细胞的扩增：将分离出的免疫细胞在体外进行培养，使其数量增加。
5. 免疫细胞的检测与鉴定：使用流式细胞术、免疫荧光等技术检测和鉴定免疫细胞的表型和功能。
6. 免疫细胞的储存：将制备好的免疫细胞在低温下保存，以便后续使用。
总之，免疫细胞的制备需要经过多个步骤，每一步都需要严格的质量控制和操作规范，以确保所得免疫细胞的质量和安全性。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
免疫学方法
免疫学方法免疫学是研究生物体对抗外源性病原体和异物的免疫应答机制的科学。
免疫学方法是研究免疫学过程和免疫学问题的一种手段，主要包括免疫学实验方法、免疫学检测方法和免疫学治疗方法等。
本文将从这几个方面对免疫学方法进行介绍。
一、免疫学实验方法。
1. 免疫细胞分离和培养。
免疫细胞分离和培养是研究免疫细胞生物学特性的重要方法。
通过离心、梯度离心、磁珠分选等技术，可以分离出各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，并进行体外培养，用于进一步的实验研究。
2. 免疫组化技术。
免疫组化技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过染色或荧光标记等方法来检测组织中特定抗原的分布和表达情况。
这项技术在病理诊断、免疫细胞定位等方面有着广泛的应用。
3. 免疫沉淀技术。
免疫沉淀技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过将抗体与抗原结合后沉淀下来，从而分离出特定的蛋白质或复合物。
这项技术在蛋白质相互作用、蛋白质结构分析等方面有着重要的应用。
二、免疫学检测方法。
1. ELISA法。
ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，通过将待检样品中的抗原或抗体与固相载体上的特异性抗体或抗原结合，再加入酶标记的二抗或底物，通过酶的催化作用产生可检测的信号，从而进行定量或半定量的检测。
2. 免疫印迹法。
免疫印迹法是通过将待检样品中的蛋白质分离、转膜到膜上，然后用特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色等方法来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
3. 流式细胞术。
流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速、高通量的检测和分析的方法，可以用于细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
三、免疫学治疗方法。
1. 免疫抑制剂。
免疫抑制剂是一类能够抑制免疫系统功能的药物，常用于器官移植术后的免疫抑制治疗，以防止移植物排斥反应。
2. 免疫增强剂。
免疫增强剂是一类能够增强免疫系统功能的药物或治疗方法，常用于免疫功能低下或免疫缺陷性疾病的治疗，以增强机体抵抗能力。
免疫细胞功能检测的方法
免疫细胞功能检测的方法
免疫细胞功能检测的方法主要包括以下几个方面：
1. 淋巴细胞转换试验：这是一种测定机体免疫功能的指标，通过淋巴细胞转化率的高低反映机体细胞免疫水平。
淋巴细胞转化率正常值一般为60.1%±7.6%，如果不在这个范围内，可能是患有出血热、麻疹等疾病。
2. FBC玫瑰花试验：这是一种检测人体T淋巴细胞的方法。
如果结果异常，可能是患有麻疹、鼻咽癌等疾病。
3. 淋巴细胞毒试验：这一般可以作为体外测定肿瘤患者细胞免疫的指标。
如果结果异常，可能是患有肾病综合征、药疹等疾病。
4. NK细胞活性测定：自然杀伤（NK）细胞是一群异质性多功能的免疫细胞，是与特异性免疫应答无关的自然毒杀伤细胞。
如果结果异常，可能是患有小儿X-连锁严重联合免疫缺陷病、先天性肿瘤等疾病。
此外，还有淋巴因子产生试验、细胞介导的细胞毒试验、抗体分泌细胞的检测、嗜中性粒细胞吞噬功能的检测、嗜中性粒细胞NBT 还原试验、巨噬细胞吞噬功能的测定等方法。
需要注意的是，患者在做细胞免疫检查的前3日，最好禁止食用
肉类以及含动物血的食物，另外检查当天的早晨一般需要空腹，否则可能会影响检查结果。
以上信息仅供参考，如有需要，建议咨询专业医师。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术免疫系统是人体的重要防御机制之一，能够识别病原体并消灭它们，维护身体的健康。
免疫细胞功能检测技术是一种用于评估免疫系统功能的测试方法，可以帮助人们更好地了解自身的免疫状况和疾病风险。
本文将介绍免疫细胞功能检测技术的原理、应用和未来发展趋势。
一、免疫细胞功能检测技术原理免疫细胞功能检测技术通过测定机体内免疫细胞的功能状态，评估免疫系统的健康状况。
其中，常见的技术包括流式细胞术、酶联免疫吸附法（ELISA）、细胞因子检测等。
1. 流式细胞术流式细胞术是一种通过流式细胞仪检测细胞表面标记物的技术，常用于检测免疫细胞的表型和活性。
通过标记细胞表面的特定抗原和荧光染料，流式细胞术可以定量测定细胞表面标记物，并进行多参数分析。
2. 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA是一种常用的免疫细胞功能检测技术，可用于定量测定体液中特定抗原或抗体的浓度。
通过将待测样品与特定抗原或抗体反应，并加入酶标记的二抗，在底物作用下形成可见的颜色反应，从而定量测定抗原或抗体的浓度。
3. 细胞因子检测细胞因子是一类在免疫反应中发挥重要调控作用的分子信号物质，如干扰素、白细胞介素等。
细胞因子检测技术可以通过ELISA等方法测定体液或细胞培养上清中细胞因子的浓度，为炎症反应的评估和免疫状态的监测提供重要信息。
二、免疫细胞功能检测技术应用免疫细胞功能检测技术在免疫学研究和临床医学中有着广泛的应用。
以下是该技术在不同领域的应用举例：1. 免疫系统疾病诊断免疫细胞功能检测技术可以帮助医生诊断免疫系统疾病，如自身免疫性疾病、免疫缺陷病等。
通过评估免疫细胞的数量、活性和功能状态，可以辅助医生制定治疗方案和判断治疗效果。
2. 肿瘤免疫治疗肿瘤免疫治疗是一种利用机体免疫系统增强对肿瘤细胞的攻击能力的治疗方法。
免疫细胞功能检测技术可以评估患者体内免疫细胞的活力和功能状态，为肿瘤免疫治疗方案的制定和疗效监测提供依据。
3. 个体化医疗免疫细胞功能检测技术还可以用于个体化医疗，根据不同个体的免疫细胞功能状况，制定相应的健康管理方案。
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
免疫细胞功能检测技术(最新)
免疫细胞功能检测技术一、前言免疫细胞功能检测技术是指通过检测免疫系统中不同类型的细胞及其功能状态来评估患者免疫系统的状态，以帮助医生诊断和治疗各种免疫性疾病。
随着免疫学研究的深入和免疫细胞功能检测技术的不断更新，现在已经出现了多种免疫细胞功能检测技术，包括流式细胞术、蛋白芯片技术、基于DNA分子杂交的检测方法等。
本文将介绍流式细胞术作为一种常用的免疫细胞功能检测技术，并详细讨论其原理、方法和应用。
二、原理流式细胞术是一种基于细胞单元分析的技术，其核心是流式细胞仪。
细胞单元分析是指将细胞单元通过高速液流分散后，在一个单元一个单元地、连续稀释、分离、悬浮状态下进行检测，获得各单元的信息。
每个单元被封装在流动液滴中，以便实现快速、准确和高通量的细胞计数和分析。
流式细胞仪通过衍射光、荧光信号及其它物理或化学性质将细胞单元分析并定量化。
流式细胞术技术可以用于对细胞表面标记、胞质内染色质、分泌物等各种指标的分析，因此适用于多种免疫细胞功能检测。
三、方法样本准备：样本的来源包括血液、脑脊液、淋巴结、脾等组织。
样本应避免受到污染和过多的处理，避免对细胞造成影响。
例如，在采血时，采用无菌针头和管道，减少离心时间，保持细胞完整。
细胞分离和染色：首先，需要将细胞从样本中分离出来，可采用离心、红细胞裂解等方法。
然后，在合适的荧光标记物和染色剂的作用下，标记或染色目标细胞。
流式细胞仪检测：样本标记后由流式细胞仪自动进样，并通过荧光激发和检测模块进行检测。
最终，获得含有多个参数的细胞单元分析结果。
四、应用免疫学研究：流式细胞术可以用于评估免疫系统中不同类型细胞及其数量、表面标记、功能状态等。
免疫性疾病诊断：如艾滋病、类风湿关节炎、自身免疫性疾病等免疫性疾病，流式细胞术可协助医生快速、准确地诊断和监测疾病的处理效果。
肿瘤治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤患者血液中的免疫细胞浸润情况，判断肿瘤对免疫系统的影响，从而指导肿瘤治疗。
五、总结流式细胞术作为一种常见的免疫细胞功能检测技术，具有高通量、多参数、准确度高等优点，在免疫学研究和临床应用中发挥着重要作用。
免疫细胞的分离与计数
实验五免疫细胞的分离与计数一、实验原理外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）包括淋巴细胞与单核细胞，其中T细胞约占50-70%，B细胞约占10-15%，单核细胞约占10-25%，还有部分NK细胞和其他细胞。
常规的促分裂原诱导的T细胞增殖试验和特异性抗原诱导的T细胞增殖试验可直接用PMBC作为靶细胞，其中混杂的单核细胞可作为抗原提呈细胞促进细胞增殖。
对于要求较高纯度T细胞的试验，可以从PMBC中再纯化T细胞。
因此，分离和获取外周血单个核细胞（PMBC）是检测T细胞免疫功能的基础。
目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法直接分离PMBC。
用来分离人和动物外周血PMBC的分离液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）—泛影酸葡甲胺（Urografin）(F/H)分离液。
当将抗凝血叠加在淋巴细胞分离液表面水平离心后，由于红细胞、粒细胞、单个核细胞、血浆等的比重不同，会出现分层现象，即在离心管中出现5层：最上层是血浆（内含血小板），血浆层和淋巴细胞分离液层之间是PMBC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黄层。
吸取血浆与淋巴细胞分离液层之间的白色细胞，即为所需的PMBC。
二、实验目的1. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的技术与细胞计数法。
2. 掌握脾细胞的分离与计数方法。
三、试剂与材料1.比重为1.077±0.001kg/L的淋巴细胞分离液；2.无菌Hank’s液（4。
C冰箱保存，临用时将PH值调至7.3-7.6）；3.1%台盼蓝染液；4.柠檬酸钠抗凝剂；5.含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液；6.仪器设备：血细胞计数板（hemocytometer）、计数器、显微镜、水平离心机、无菌注射器、碘酒、酒精、无菌试管、无菌吸管、微量移液器和无菌枪头。
免疫细胞检测技术
免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。
各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。
本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。
一．免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。
它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。
细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质(表面标记)来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。
根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。
免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。
基于细胞物理性状的分离方法(一)根据各种细胞比重的差异1.自然沉降法2.密度梯度离心法人外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.00左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075左右。
利用密度在l.077万±0.001之间近于等渗的Ficoll-Hypque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。
血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o（如图1-1所示）图1-1 淋巴细胞分离示意图3.改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心将T细胞分离。
免疫细胞功能的测定
免疫细胞功能的测定
第26页
ELISPOT法
B细胞产生抗体能力测定
技术方法
1. 抗原包被: 37C°2h，或4C°过夜。固相载 体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96 孔板。
2. 抗体生成细胞培育: 加入适量抗体生成细胞， 37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤， 去除为与固相结合细胞。
3. 测定斑点产生细胞: 加二抗， 37C°，5％ CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷 酸酶和底物显色。
免疫细胞功能的测定
免疫细胞功能的测定
第1页
免疫细胞功效测定
T细胞增殖功效测定
基础理论
本技术用于评定T细胞对各种刺激增殖能力。T 细胞增殖能力是反应T细胞功效一个主要指标。
免疫细胞功能的测定
第2页
T细胞功效测定
刺激T细胞增殖原因及意义 1. 特异性抗原: 引发寡克隆活化增殖。 克用于判断抗原免疫效果（疫苗接种）和回 想反应能力，也能反应T细胞总体功效。 2. 丝裂原: 多克隆。 3. 刺激信号转导分子: 多克隆。
免疫细胞功能的测定
第29页
B细胞产生抗体能力测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
方法
1. 包板: 96孔板用浓度为10µg/ml特异性单抗 包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h， 或4C°过夜。常规洗板，封闭。
2. 上样: 每孔内加入1:10或1:20 稀释细胞培养 上清液100µl。阳性对照为标准品，阴性对 照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h， 或4C°过夜。
2. 培养液中添加血清: 有些血清可能激活或抑 制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力， 可采取灭活AB血清。
3. 细胞培养板类型: 依据细胞数量采取不一样 形状底部培养板。
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• (三)磁铁吸引法
• 利用单核细胞具有吞噬的特性，在 悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细 胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸 至管底，上层液中含较纯的淋巴细 胞群。
（四）Percoll分离法 78％ 98％
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三、T、B细胞和T细胞亚群的分离
• 免疫磁珠分离法 • 流式细胞术分离法 • 其他方法
二、树突状细胞
（dendritic cells，DC） 特征：
• 形态呈树突样 • 具有一些相对特征性表面标志 • 抗原提呈能力强能激活初始T细胞 • 免疫应答的始动者
DC主要标志：CD1a、CD11c、CD83
1.起源于造血干细胞 由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分
化。 2.表面标志丰富
如 ： MHCⅡ 类 分 子 及 Ⅰ 类 分 子 、 B7-1 和 B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。 3.分泌多种细胞因子 IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等。
淋
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
示
意
放射性测定
3H-TdR摻入法
（二）T细胞分泌功能检定
淋巴细胞内细胞因子检测
原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑 制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞 内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔 基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的 细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2细胞的百分率。
Ficoll分层液分离单个核细胞示意图
二、淋巴细胞的分离 纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在37℃和Ca离子存在
条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉 花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单 个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度 的淋巴细胞群。
(一)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离 的淋巴细胞群中B细胞有所损失。 (二)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的 主要是淋巴细胞
第四节 T细胞功能检测
• 一、T细胞功能检测
（一）T淋巴细胞增殖试验
刺激物
淋巴细胞
DNA合成
分化
母细胞
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
淋巴细胞转化的检测方法
• 形态学检查法 • 3H-TdR掺入法 • MTT比色法
形态学检查法
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
（一）免疫磁珠分离 法
流
式
488 nm 激光
细
胞
术
分 离 原
-
电磁场
理
示
单个细胞被分类
意
进入检测管
图
前向散射光 检测器
荧光检测器
+
• 第二节 淋巴细胞表面标志 的检测及亚群分类
一、T细胞表面标志及亚 群
CD4+T CD3+CD4+CD8主要为Th（help T cell）辅助性T细胞
CD8+T CD3+CD4-CD8+ 主要为Tc（cytotoxic T cell）细胞毒性T细胞
免疫细胞种类
免疫细胞的分离流程
外周血
PBMC
纯淋巴细胞
TC亚群/BC亚群
T、B细胞
一、 外周血单个核细胞的分离和纯化
• PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 • 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 • 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll
外周血各细胞成分的密度
细胞 血小板
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理：
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
PBMC
多核白细胞
红细胞
比重
1.030~1.035 1.075~1.090 1.092
1.093
一、Ficoll分离法
Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心 的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 • Ficoll分层液：密度1.077±0.001 • 离心：密度梯度离心 • 分离：各类细胞按其相应密度重新分布
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
计算SI
3H-TdR掺入法
刺激指数（stimulating index，SI ） SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值
评价：该方法敏感性高、客观性强、重复 性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。
丝裂原（抗原）刺激
目的要求
掌 握 ： Ficoll-hypaque 分 层 液 分 离 PBMC 的 原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、 方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细 胞的数量及功能的检测；
熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的 细胞毒检测的方法；
了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、 吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。
二、B细胞表面标志及亚群亚群
三、 NK细胞表面标志
NK细胞典型标志：CD56和CD16
第三节 抗原提呈细胞表面标志
抗原提呈细胞（APC）： 是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈 给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。
单核-巨噬细胞
树突状细胞
（一）单核吞噬细胞（CD14）
1.吞噬和杀伤作用 2.杀伤肿瘤细胞 （1）分泌TNF-α、NO、反应氧中间产物及蛋 白水解酶等 （2）ADCC效应 （3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞 协同杀伤肿瘤细胞。
Thl和Th2分泌的细胞因子
分泌的细胞因子
Thl
Th2
IL-2 IFN-γ TNF-β IL-3 GM-CSF TNF-α IL-4 IL-5 IL-6 IL-10
++
-
++
-
++
++
+
++
+
++
-
++
-
++
-
++
-
++
-
++
（三）T细胞介导的细胞毒试验
原理:
靶细胞抗原
T细胞
致敏CTL
靶细胞
第一节 免疫细胞的分离
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
免疫细胞的起源与分化
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞