免疫细胞分离与功能检测

合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
计算SI
3H-TdR掺入法
刺激指数（stimulating index，SI ） SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值
评价：该方法敏感性高、客观性强、重复 性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。
丝裂原（抗原）刺激
免疫细胞种类
免疫细胞的分离流程
外周血
PBMC
纯淋巴细胞
TC亚群/BC亚群
T、B细胞
一、 外周血单个核细胞的分离和纯化
• PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 • 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 • 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll
外周血各细胞成分的密度
细胞 血小板
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
பைடு நூலகம்6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理：
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
二、B细胞表面标志及亚群亚群
三、 NK细胞表面标志
NK细胞典型标志：CD56和CD16
第三节 抗原提呈细胞表面标志
抗原提呈细胞（APC）： 是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈 给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。
单核-巨噬细胞
树突状细胞
（一）单核吞噬细胞（CD14）
1.吞噬和杀伤作用 2.杀伤肿瘤细胞 （1）分泌TNF-α、NO、反应氧中间产物及蛋 白水解酶等 （2）ADCC效应 （3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞 协同杀伤肿瘤细胞。
（一）免疫磁珠分离 法
流
式
488 nm 激光
细
胞
术
分 离 原
-
电磁场
理
示
单个细胞被分类
意
进入检测管
图
前向散射光 检测器
荧光检测器
+
• 第二节 淋巴细胞表面标志 的检测及亚群分类
一、T细胞表面标志及亚 群
CD4+T CD3+CD4+CD8主要为Th（help T cell）辅助性T细胞
CD8+T CD3+CD4-CD8+ 主要为Tc（cytotoxic T cell）细胞毒性T细胞
第四节 T细胞功能检测
• 一、T细胞功能检测
（一）T淋巴细胞增殖试验
刺激物
淋巴细胞
DNA合成
分化
母细胞
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
淋巴细胞转化的检测方法
• 形态学检查法 • 3H-TdR掺入法 • MTT比色法
形态学检查法
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
目的要求
掌 握 ： Ficoll-hypaque 分 层 液 分 离 PBMC 的 原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、 方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细 胞的数量及功能的检测；
熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的 细胞毒检测的方法；
了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、 吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。
Ficoll分层液分离单个核细胞示意图
二、淋巴细胞的分离 纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在37℃和Ca离子存在
条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉 花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单 个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度 的淋巴细胞群。
(一)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离 的淋巴细胞群中B细胞有所损失。 (二)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的 主要是淋巴细胞
• (三)磁铁吸引法
• 利用单核细胞具有吞噬的特性，在 悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细 胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸 至管底，上层液中含较纯的淋巴细 胞群。
（四）Percoll分离法 78％ 98％
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三、T、B细胞和T细胞亚群的分离
• 免疫磁珠分离法 • 流式细胞术分离法 • 其他方法
PBMC
多核白细胞
红细胞
比重
1.030~1.035 1.075~1.090 1.092
1.093
一、Ficoll分离法
Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心 的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 • Ficoll分层液：密度1.077±0.001 • 离心：密度梯度离心 • 分离：各类细胞按其相应密度重新分布
淋
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
示
意
放射性测定
3H-TdR摻入法
（二）T细胞分泌功能检定
淋巴细胞内细胞因子检测
原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑 制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞 内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔 基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的 细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2细胞的百分率。
二、树突状细胞
（dendritic cells，DC） 特征：
• 形态呈树突样 • 具有一些相对特征性表面标志 • 抗原提呈能力强能激活初始T细胞 • 免疫应答的始动者
DC主要标志：CD1a、CD11c、CD83
1.起源于造血干细胞 由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分
化。 2.表面标志丰富
如 ： MHCⅡ 类 分 子 及 Ⅰ 类 分 子 、 B7-1 和 B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。 3.分泌多种细胞因子 IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等。
Thl和Th2分泌的细胞因子
分泌的细胞因子
Thl
Th2
IL-2 IFN-γ TNF-β IL-3 GM-CSF TNF-α IL-4 IL-5 IL-6 IL-10
++
-
++
-
++
++
+
++
+
++
-
++
-
++
-
++
-
++
-
++
（三）T细胞介导的细胞毒试验
原理:
靶细胞抗原
T细胞
致敏CTL
靶细胞
第一节 免疫细胞的分离
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
免疫细胞的起源与分化
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞