免疫细胞功能检测技术17316

一、中性粒细胞功能的检测
➢ 细胞趋化功能的检测 ➢ 吞噬和杀菌功能的检测
(一) 细胞运动功能——趋化功能检测
1.原理：
2. 方法： 滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
(二)吞噬和杀菌功能测定 1．显微镜检查法：
吞噬率 (%)
吞噬细菌的白细胞数 100
计数的白细胞数
杀菌率 (%)胞内含着染菌体数 的细 10胞 0 计数的白细胞数
2. 方法学：
➢ 经典溶血空斑形成试验 ➢ 被动溶血空斑试验
3．临床应用与评价
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和 手术等因素对体液免疫功能的影响 ➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产 生抗体的能力。
(三) B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法ELISPOT
1.原理：
2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 ➢优点：
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
➢优点：形态学方法简便易行，普通光 学显微镜便能观察结果，适于基层实验 室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化， 判断结果易受主观因素影响，重复性和 准确性较差。
（2）3H-TdR掺入法
培养 液 PHA
3H-TdR
淋巴细胞
全
血源自文库
离
心
分层 液
过滤 测 量 放 射 性
试验孔A均值 SI对照孔 570An均 m值
免疫细胞功能检测技术17316
一 淋巴细胞的功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外 实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对 抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体 外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂 原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴 细胞分泌产物的测定
淋巴细胞
➢T细胞（负责细胞免疫功能） ➢B细胞（执行体液免疫功能） ➢NK细胞（非特异性免疫作用）
（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
T细胞 靶细胞
致敏CTL
观察杀伤活力
2.方法
➢形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残 留肿瘤细胞
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
图15-2 T细胞细胞毒试验示意图
51Cr释放法
靶细胞 51Cr
洗 涤
去除游离 的51Cr
效应细胞
测量上清液中 释放的51Cr
一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成 母细胞
分化
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20
570nm
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观 性强，重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在 放射性核素污染问题。
(3) MTT 比色法
培养 液
PHA
3H-MTTdTR
淋巴细胞
全
血
离
心
分层 液
过滤 测 量测 放吸 射性光度
(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激 后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生 物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、 生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功 能。
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
(四) 体内试验
➢体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、 破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ➢将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫 前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血 清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内B细胞的功能。
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
(二)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞 噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、 酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收 集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细 胞。
2. 溶菌法
杀菌 (% （ 1 率 )作 3、 用 6 0或 0 9m 0菌 in 落 ） 10 数 0 0m菌 in 落数
3．NBT还原试 验
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲臜（紫黑色）
中性粒细胞 NBT 甲臜颗粒沉积于胞质中
二、巨噬细胞功能检测
混合培养4-6小时
(四) 体内试验
➢特异性抗原皮肤试验 ➢PHA皮肤试验
二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
(一)B细胞增殖能力的试验
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
B细胞增殖
形态学
3H－TdR掺入 法
(二) 溶血空斑试验
1. 原理：
谢谢观赏
(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定
1．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法
2．非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法
(四) 细胞毒作用测定
用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对 125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤 P815的杀伤活性。
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的 凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为 此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2 混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试 管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。
三、NK细胞活性测定
➢形态法 ➢酶释法 ➢荧光法 ➢同位素法 ➢化学发光法
染色计数
靶 离心取上清
细 测LDH或AKP
胞 溶 解
离心取沉淀 测活细胞荧光
测CPM值
测发光强度
常用靶细胞: K562细胞株
二 吞噬细胞功能检测技术
按其形态大小分为两类： 大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统 小吞噬细胞—中性粒细胞
特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
3. 检测方法
形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3HTdR掺入
收集细胞
检测β射线
测定细胞内的3H－TdR
（1）形态学检查法
转化率
转化的淋巴细胞数 10% 0
转化和未转化的胞淋数巴细
方法学评价：