化妆品微生物检验方法
《化妆品微生物标准检验方法》GB7918.1～5――87
《化妆品微生物标准检验方法》GB7918.1～5――87一、总则General Principle1 范围本规范规定了化妆品微生物学检验总则。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存、供检样品制备。
2 仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶。
2.5 玻璃珠。
2.6 玻璃棒。
2.7 刻度吸管。
2.8 研钵。
2.9 均质器。
2.10 恒温水浴箱。
2.11 采样用具：不锈钢勺，剪刀，开罐器等。
3 培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠蒸馏水加至3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖卵磷脂吐温80 蒸馏水17g 3g 5g 2.5g 2.5g 1g 7g 1000mL8.5g 1000 mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌。
制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3，分装，103.43kPa(15lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温80。
4 样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量应适量增加，其总量应大于16g。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态，进口产品应为市售包装。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一份样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，应先做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。
化妆品微生物检验方法标准
化妆品微生物检验方法标准概述：化妆品微生物检验是对产品中的微生物含量和活性进行检测，旨在确保化妆品的质量和安全性。
本文将介绍化妆品微生物检验的方法标准，包括采样方法、微生物总数测试、致病微生物测试等内容。
一、采样方法采样是化妆品微生物检验的第一步，正确的采样方法对检验结果的准确性至关重要。
总体的采样方法包括以下几个方面：1. 选取适当数量和规格的样品，并确保样品具有代表性；2. 使用干净的取样工具，避免污染样品；3. 选择不同生产批次和生产日期的化妆品进行采样，以评估产品的质量稳定性；4. 遵循严格的卫生规范和操作规程进行采样。
二、微生物总数测试微生物总数测试是对化妆品样品中微生物总数量的测定。
其目的是评估产品的细菌污染程度和是否符合相关的卫生标准。
以下是常用的微生物总数测试方法：1. 高效液相色谱法（HPLC）：该方法通过分离、测定化妆品中微生物代谢产物的含量，从而推断微生物总数；2. 膜过滤法：通过将样品通过膜过滤器，然后将膜培养在适当的培养基上，计数培养基上出现的菌落数量；3. 稀释平板计数法：将样品进行系列稀释后，移取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的平板上，培养并计数菌落数量；4. 流式细胞术：利用流式细胞仪对样品中微生物进行计数和鉴定。
三、致病微生物测试致病微生物测试是对化妆品样品中致病微生物含量的检测。
该测试主要关注常见的致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
以下是常用的致病微生物测试方法：1. 酶免疫分析法（ELISA）：通过检测样品中致病菌特异性的抗原或抗体来判断样品是否存在致病菌；2. PCR技术：通过引物特异性扩增样品中的致病菌DNA，从而检测样品是否受到致病菌污染；3. 快速培养技术：利用快速培养方法，减少培养周期，快速检测致病菌的存在。
四、标准和参考文献化妆品微生物检验方法的标准和参考文献主要包括国际组织和国家相关机构发布的标准。
以下是几个常见的标准：1. 国家药品监督管理局发布的《化妆品质量规范》2. 国际标准化组织（ISO）发布的相关标准，如ISO 21149：2020 "Cosmetics -- Microbiology -- Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria"3. 美国食品药品管理局（FDA）发布的相关指导文件，如《微生物检验的尺度适应性》总结：化妆品微生物检验是保证化妆品质量和安全的重要环节。
化妆品中的微生物检测方法探讨
化妆品中的微生物检测方法探讨化妆品是现代人日常生活中常用的美容护肤品，然而，由于其在制造和包装过程中不可避免地存在微生物的污染风险，因此对于化妆品中微生物的检测方法变得尤为重要。
本文将探讨化妆品中常用的微生物检测方法，并分析其优缺点。
一、传统微生物检测方法1.1 培养基计数法培养基计数法是一种传统的微生物检测方法，主要通过将样品接种在富含营养成分的培养基上，利用培养基上微生物生长的可见指标，例如菌落的形状、大小和颜色，来进行微生物数量的估计。
这种方法的优点是相对简单易行，且可以获得微生物的种类和数量信息。
然而，由于微生物的生长需要一定的时间，培养基计数法的缺点在于结果的获取较为耗时，并且可能存在某些难以培养的微生物无法被检测出的问题。
1.2 涂布法涂布法是另一种传统的微生物检测方法，通过将样品涂布在培养基表面，让微生物在培养基上生长并形成可见的菌落。
然后再通过对菌落的计数，来估算样品中微生物的数量。
然而，这种方法同样存在时间耗费长和部分微生物无法被检测出的问题。
二、现代微生物检测方法2.1 PCR法聚合酶链反应（PCR）是一种现代的微生物检测方法，通过扩增微生物DNA片段，从而实现对微生物的定性和定量分析。
PCR法具有高度的灵敏度和特异性，能够检测到微生物以及微生物中的基因信息。
此外，PCR法还能够快速获得结果，并且对某些难以培养的微生物也能进行检测。
然而，PCR法存在着杂交污染和检测结果易受到外界干扰等问题。
2.2 DNA测序法DNA测序法是一种可以获得微生物遗传信息的高通量测序技术，通过对微生物样品中的DNA进行测序，可以获取到微生物的基因序列，并进一步了解微生物的种类和数量。
DNA测序法具有高灵敏度、高分辨率和广泛的适用性，能够检测到微生物的种类和潜在致病因子。
但是，DNA测序法的操作复杂，且成本较高，因此在实际应用中受到一定的限制。
2.3 荧光定量PCR法荧光定量PCR法（qPCR）通过利用特定标记的引物和荧光探针，能够实现对微生物DNA的定量分析。
化妆品微生物检验方法
lb)20min高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25C左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
灭菌液体石蜡。
灭菌吐温80。
4.样品的采集及注意事项
所采集的样品， 应具有代表性， 一般视每批化妆品数量大小， 随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mLo包装量小于20g的样品，采样
稀释法进行。如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1:10检液。
油性液体样品，取样品10mL，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80,在40C〜44C水浴中充分混合，制成1:10检液。
固体样品
的检液。10:1灭菌生理盐水中， 充分振荡混匀， 使其分散混悬， 静置后， 取上清液作为90mL，加到10g称取．
2.定义 本规范采用下列定义 菌落总数(Aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培
养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得
结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生总评价的综合依据。
1000,1:10000，……等，每种稀释度应更换1支吸管。
将融化并冷至45C〜50C的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL,随 即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36C士1C培养箱内
培养48h士2h。另取一个不加样品的灭菌，2h士48hC培养箱内培养1C士36置翻转平皿，待琼
化妆品原料微生物检验标准
化妆品原料微生物检验标准一、细菌总数1.目的：评估化妆品原料的细菌污染程度，反映化妆品生产过程中的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行细菌总数的测定。
3.判定标准：细菌总数小于或等于1000 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
二、霉菌和酵母菌总数1.目的：评估化妆品原料的霉菌和酵母菌污染程度，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行霉菌和酵母菌总数的测定。
3.判定标准：霉菌和酵母菌总数小于或等于100 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
三、耐热大肠菌群1.目的：检测化妆品原料中是否存在耐热大肠菌群，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行耐热大肠菌群的测定。
3.判定标准：未检出耐热大肠菌群为合格，检出耐热大肠菌群为不合格。
四、金黄色葡萄球菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在金黄色葡萄球菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行金黄色葡萄球菌的测定。
3.判定标准：未检出金黄色葡萄球菌为合格，检出金黄色葡萄球菌为不合格。
五、铜绿假单胞菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在铜绿假单胞菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行铜绿假单胞菌的测定。
3.判定标准：未检出铜绿假单胞菌为合格，检出铜绿假单胞菌为不合格。
六、沙门氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在沙门氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行沙门氏菌的测定。
3.判定标准：未检出沙门氏菌为合格，检出沙门氏菌为不合格。
七、志贺氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在志贺氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行志贺氏菌的测定。
3.判定标准：未检出志贺氏菌为合格，检出志贺氏菌为不合格。
八、大肠埃希氏菌O157:H71.目的：检测化妆品原料中是否存在大肠埃希氏菌O157:H7，预防感染性疾病的发生。
化妆品微生物检测标准
化妆品微生物检测标准
一、细菌总数检测
细菌总数是指化妆品中含有的细菌类微生物的总数。
细菌总数是评价化妆品卫生质量的重要指标之一，也是反映化妆品被污染程度的重要指标之一。
实验原理：采用倾注平板法，将一定体积的样品注入细菌培养基中，经过培养后，细菌在培养基表面生长繁殖形成菌落，通过计数菌落数，可以推测出样品中细菌的总数。
实验步骤：
（1）将样品进行适当稀释；
（2）将一定体积的稀释液注入细菌培养基中；
（3）将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养；
（4）观察菌落的生长情况，并进行计数。
注意事项：
（1）实验前要对手部进行消毒，避免污染样品和培养基；
（2）实验过程中要使用无菌技术和无菌器材；
（3）实验后要对培养基进行灭菌处理。
二、大肠菌群检测
大肠菌群是指一群好氧性芽孢杆菌，它们的出现意味着化妆品可能被粪便污染。
实验原理：采用滤膜法，将一定体积的样品通过滤膜过滤，将滤膜放在培养基上培养，观察是否有大肠菌群生长。
实验步骤：
（1）将样品进行适当稀释；
（2）将滤膜放在过滤器上，将稀释液过滤；
（3）将滤膜放在培养基上培养；
（4）观察是否有大肠菌群生长。
注意事项：
（1）实验前要对手部进行消毒，避免污染样品和培养基；
（2）实验过程中要使用无菌技术和无菌器材；
（3）实验后要对培养基进行灭菌处理。
三、肠道致病菌检测
肠道致病菌是指能够引起肠道疾病的细菌，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。
实验原理：采用生化反应和血清学试验等方法，对样品中的肠道致病菌进行检测。
化妆品中的微生物性评估方法研究
化妆品中的微生物性评估方法研究一、引言化妆品作为人们日常护肤的必备品，其安全性和质量问题备受关注。
其中微生物污染是一个重要的问题，可能导致皮肤病等健康问题。
因此，加强对化妆品中微生物性评估方法的研究，势在必行。
本文将介绍当前应用于化妆品微生物性评估的主要方法和技术，以及相关的研究进展。
二、传统的微生物检测方法1. 培养法培养法是目前应用最广泛的微生物检测方法之一。
它通过将化妆品样品与培养基接种于培养基平板，培养一定时间后，观察和计数微生物菌落来评估样品的污染情况。
这种方法具有操作简单、成本低的特点，但是需要较长的培养时间，且无法检测到需特殊培养条件的微生物。
2. 酶标仪法酶标仪法利用特定的酶反应来检测微生物的存在。
例如，ATP酶标仪法通过检测样品中的ATP含量来间接评估微生物的数量。
这种方法具有操作快捷、结果迅速的优点，但是对于混合体系和耐热菌的检测能力有限。
三、现代微生物评估方法1. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种利用特定引物扩增微生物核酸片段的技术。
它具有高灵敏度、高特异性、快速反应速度等优势，并且可以检测到需特殊培养条件的微生物。
同时，PCR法还可以结合DNA测序技术进行微生物物种鉴定。
2. 荧光定量PCR法荧光定量PCR法是PCR技术的一种改进方法。
它通过引入荧光探针，并结合荧光定量仪，可以定量检测微生物的存在和数量。
这种方法不仅具有PCR技术的优点，还能够提供更准确和精确的微生物定量结果。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种将微生物与荧光标记的抗体或荧光染料结合，通过流式细胞仪检测和计数微生物的方法。
它可以高通量、高灵敏度地检测微生物，且操作简便，结果准确。
四、研究进展近年来，随着生物技术和仪器设备的不断发展，许多新的微生物评估方法和技术不断涌现。
例如，基因测序技术的应用使得微生物物种的鉴定更为准确。
微流控技术的引入使得微生物的快速筛查和分析成为可能。
此外，一些研究还探索了利用机器学习算法和人工智能技术进行微生物性评估的方法，提高了评估的效率和准确性。
化妆品产品微生物检验方法
GMP-WI-09化妆品产品微生物检验方法目录1.微生物检验方法总则2.菌落总数检验方法3.霉菌和酵母菌检验方法微生物检验方法总则1 范围本部分规定了化妆品微生物学检验的基本要求。
本部分适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2 仪器和设备2.1 天平，0-200g，精确至 0.1g。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL、150mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 玻璃棒。
2.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。
2.8 恒温水浴箱。
2.9 均质器或研钵。
2.10 灭菌均质袋。
3 培养基和试剂3.1生理盐水成分：氯化钠 8.5g蒸馏水加至 1000mL制法：溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶 90mL，121℃高压灭菌 20min。
3.2 SCDLP 液体培养基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 2.5g卵磷脂 1g吐温 80 7g蒸馏水 1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解，调 pH为7.2—7.3分装，每瓶90mL，121℃高压灭菌20min。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温 80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
制法：取液体石蜡 50mL，121℃高压灭菌 20min。
3.4 灭菌吐温 80。
制法：取吐温 80 50mL，121℃高压灭菌 20min。
4 样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应从不少于 2 个包装单位的取样中共取 10g 或 10mL。
包装量小于 20g 的样品，采样时可适当增加样品包装数量。
4.2 供检样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
化妆品微生物检验方法
化妆品微生物检验方法在化妆品行业中，微生物检验是非常重要的过程。
因为化妆品中如果含有微生物，那么就会对人体带来危害。
那么，微生物检验方法有哪些呢？1.总菌落数检测法化妆品内的总菌落数是微生物检测的重点指标。
一般情况下，微生物的总数应该符合相关法规，不得超标。
检测总菌落数的方法通常采用平板计数法。
这种方法的基本步骤是，将一定数量的化妆品样品取出用无菌平板和无菌营养琼脂培养基进行平板计数，然后进行培养和计数。
2.霉菌和酵母菌检测法霉菌和酵母菌也是影响化妆品质量的重要微生物。
一般情况下，化妆品中的霉菌和酵母菌的数量也要符合相关法规的要求。
目前，霉菌和酵母菌检测的方法有两种，其中一种是表面计数法，另一种则是过滤法。
3.厌氧菌检测法厌氧菌是在低氧或无氧环境下生长的微生物，在化妆品行业中，一般用于指检测闭口容器中的细菌。
厌氧菌检测方法主要采用Vial计数法。
此法用于检测闭口容器中微生物数目。
4.病原微生物检测法病原微生物在化妆品中是较少出现的，不过，如果化妆品中含有病原微生物，那么会对人体健康带来严重的后果。
常见的病原微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
检测该类微生物的方法则主要采用生化鉴别试验、酸碱指示剂培养和快速检测法。
5.防腐剂破产检测法防腐剂是一种能够防止微生物生长的药品，但该类药品会有破产的情况，即也就是防腐能力下降。
防腐剂破产的化妆品会对人体产生一定的危害，因此，也需要进行检测。
检测方法则是先将化妆品样品进行稀释，然后加入相应的菌苗和营养琼脂培养基，进行培养和计数。
综上所述，微生物检验对于化妆品的质量控制至关重要，而化妆品生产企业一定要严格按照相关法规来进行检测，以确保安全性和可靠性。
化妆品微生物检测流程
分 别 取检 液 1ml 注入两个 平皿和 9ml 生 理盐水试管中。
将试管混匀，分 别取 1ml 注入 两个灭 平皿，
（如样品菌量
高，再适当稀
释）
将 45-50℃的卵 磷脂吐温 80 营 养琼脂倾注至 平皿内，每皿约 15ml ，使检液 与培养基充分 混匀，并做空 白，待琼脂凝固 后倒置平皿于 36±1℃培养箱 内培养 48±2 小时 (为区分 颗粒和菌落，可 在每 100ml 琼 脂中加入 1ml 0.5%的 TTC 溶液)
1：10、1： 100、1： 1000分别 取1：10、 1：100、1： 1000检液 1ml 注入 两个平 皿，注入 融化并冷 至45± 1℃左右 的虎红培 养基，充 分摇匀。 翻转平 板，置28 ±1℃培 养72± 2h，计数。 若有霉菌 蔓延生 长，为避 免影响其 它霉菌和 酵母菌的 计数时， 于48±2h 应及时将 此平板取 出计数。
取可疑菌落2 -3 个，分别接种在 绿脓菌素测定 培养基上，置 36℃±1℃培养 24h±2h，加入 氯仿3-5mL，充 分振荡使培养 物中的绿脓菌 素溶解于氯仿 液，待氯仿提取 液呈蓝色时，用 吸管将氯仿移 到另一试管中 并加入1mol/L 的盐酸1mL 左 右，振荡后，静 置片刻。•上层 盐酸液内出现 粉红色到紫红 色时为阳性，表 示被检物中有 绿脓菌素存在。
被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆 为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明 胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜 绿假单胞菌。
挑取培养物，划线接种在•Baird Parker 氏培养基，，置36-±1℃培养 24-48h。。挑取单个菌落分纯在血琼 脂平板上，置36±1℃培养24±2h。
化妆品微生物检验方法
一、总则之相礼和热创作本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求.本规范适用于化妆品样品的网络、保管及供检样品制备.2.1 天平.2.2 高压灭菌器.2.3 振荡器.2.4 三角瓶，250mL.2.5 玻璃珠.2.6 琉璃棒.2.7 刻度吸管，1mL、10mL.2.8 研钵或均质器.2.9 恒温水浴箱.3.1 生理盐水成分：蒸馏水加至 1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌.3.2 SCDLP液体培育基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g葡萄糖 1g吐温80 7g蒸馏水1000mL～7.3分装，103.43kPa(121℃ 15lb)20min高压灭菌.留意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右运用.注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替.3.3灭菌液体石蜡.3.4灭菌吐温80.4.1 所网络的样品，应具有代表性，一样平常视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位.检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g 或10mL.包装量小于20g的样品，采样量可得当添加样品包装数量.4.2 供检验样品，应严厉坚持原有的包装形状.容器不该有决裂，在检验前不得打开，防止样品被净化.4.3 接到样品后，应马上登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验.如不克不及及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻.4.4 若只要一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做别的分析.4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操纵结束，均须防止微生物的再净化和扩散，所用器皿及材料均应事前灭菌，全部操纵应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操纵规定进行.4.6如检出粪大肠菌群或别的致病菌，自陈述发出之日起该菌种及被检样品应保管一个月.5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍浓缩法进行.如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1：10检液.5.1.2 油性液体样品，取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL 灭菌的吐温80,在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液.5.3 固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液.如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加入10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min.二、菌落总数本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法.本规范适用于化妆品菌落总数的测定.本规范采取下列定义菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在肯定条件下培育后（如培育基成分、培育温度、培育工夫、pH值、需氧性子等），1g(1mL)检样中所含菌落的总数.所得结果只包含一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数.测定菌落总数便于判明样品被细菌净化的程度，是对样品进行卫生总评价的综合根据.3.1 三角瓶，250mL.3.2 量筒，200mL.3.3 pH计或周密pH试纸.3.4 高压灭菌器.3.5 试管：15×150mm.3.6 灭菌平皿：直径9cm.3.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.8 酒精灯.3.9 恒温培育箱：36℃±1℃.3.10 放大镜.4.1 生理盐水：见总则中3.1.4.2 卵磷脂、吐温80-养分琼脂培育基4.2.1成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到大批蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到别的的蒸馏水中，溶解.加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.1～7.4,加入琼脂，103.43kPa(121℃ 15lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用.4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：蒸馏水 1000mL溶解后过滤，103.43kPa (121℃15lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用.5.1 用灭菌吸管汲取1：10浓缩的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（留意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液.汲取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.如样品含菌量高，还可再浓缩成1：1000,1：10000，……等，每种浓缩度应更换1支吸管.5.2 将消融并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80养分琼脂培育基倾注到平皿内，每皿约15mL,随即转动平皿，使样品与培育基充分混合均匀，待琼脂凝结后，翻转平皿，置36℃±1℃培育箱内培育48h±2h.另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80养分琼脂培育基，待琼脂凝结后，翻转平皿，置36℃±1℃培育箱内培育48h±2h，为空白对照.5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80养分琼脂中加入1mL 0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培育后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变更.6．菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍的放大镜检查，以防脱漏.记下各平皿的菌落数后，求出同一个浓缩度各平皿生长的均匀菌落数.若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数.若片状菌落不到平皿中的一半，而别的一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2,以代表全皿菌落数.7.1 首先选取均匀菌落数在30个～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围.当只要一个浓缩度的均匀菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其浓缩倍数（见表1中例1）.7.2 若有两个浓缩度，其均匀菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2,应陈述其均匀数，若大于2则陈述其中浓缩度较低的平皿的菌落数（见表1中例2及例3）.7.3 若全部浓缩度的均匀菌落数均大于300个，则应按浓缩度最高的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例4）.7.4 若全部浓缩度的均匀菌落数均小于30个，刚应按浓缩度最低的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例5）.7.5 若全部浓缩度的均匀菌落数均不在30个～300个之间，其中一个浓缩度大于300个，而相邻的另一浓缩度小于30个时，则以30或300的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例6）.7.6 若全部的浓缩度均无菌生长，陈述数为每g或每mL小于10 CFU.7.7 菌落计数的陈述，菌落数在10以内时，按实无数值陈述之，大于100时，采取二位无效数字，在二位无效数字后面的数值，应以四舍五入法计算.为了延长数字后面零的个数，可用10的指数来暗示（见表1陈述方式栏）.在陈述菌落数为“不成计”时，应注明样品的浓缩度.表1 细菌计数结果及陈述方式例次分歧浓缩度均匀菌落数两浓缩度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g）陈述方式(CFU/mL或CFU/g）10-110-210-31 1365 164 20 ——16400 ×1042 2760 295 46 38000 ×1043 2890 271 60 27100 ×1044 不成计4650 513 ——513000 ×1055 27 11 5 ——270 ×1026 不成计305 12 ——30500 ×1047 0 0 0 ——＜1×10 ＜1×10*CFU：菌落构成单位.三、粪大肠菌群本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法.本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验.本规范采取下列定义粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44℃±℃培育24h～48h能发酵乳糖产酸并产气.该菌直接来自粪便，是紧张的卫生目标菌.3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±℃.3.2 温度计.3.3 显微镜.3.4 载玻片.3.5 接种环.3.6 电磁炉.3.7 三角瓶，250mL.3.8 试管：15×150mm.3.9 小倒管.3.10 pH计或pH试纸.3.11 高压灭菌器.3.12 灭菌吸管，10mL、1mL.3.13 灭菌平皿：直径90mm.4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培育基成分：蛋白胨 40g猪胆盐 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐温80 14g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min高压灭菌.4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g2%伊红水溶液 20mL0.5%美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mLkPa (121℃15lb)15min高压灭菌备用.临用时加入乳糖并加热消融琼脂.冷至60℃左右无菌操纵加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀.倾注平皿备用.4.3 蛋白胨水（做靛基质实验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min高压灭菌.4.4 靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL.实验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±℃培育24h±2h.沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管.阳性者于试剂层显深玫瑰红色.注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可运用.4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫 1g95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合.4.5.1.2 革兰氏碘液：碘 1g碘化钾 2g蒸馏水加至 300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL.4.5.1.3 脱色液：95%乙醇.4.5.1.4 复染液：（1）沙黄复染液：95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水浓缩.（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL,放置过夜，滤纸过滤.取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL,混合，即为石碳酸复红液.再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液.4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗.4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗.4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s,或将乙醇滴满整个涂片，马上倾往，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s,水洗.4.5.2.4 滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检.4.5.3 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色.注：如用1：10浓缩石碳酸复红液做复染，复染工夫仅需10s.5.1 取10mL 1：10浓缩的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培育基中，置44℃±℃培育箱中培育24h～48h，如不产酸也不产气，则陈述为粪大肠菌群阴性.5.2 如产酸产气，则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培育18h～24h.同时取该培育液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±℃培育24h±2h.经培育后，在上述平板上观察有无典型菌落生长.粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培育基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边沿划一，概况光滑潮湿，常具有金属光泽.也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应留意挑选.5.3 挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检.5.4 在蛋白胨水培育液中，加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应.阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂赋性.根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证明为革兰氏阴性杆菌，靛基质实验阳性，则可陈述被检样品中检出粪大肠菌群.四、铜绿假单胞菌本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法.本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验.本规范采取了下列定义铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能发生绿脓菌素.此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长.该菌对人有致病力，可使伤处化脓，惹起败血症等.3.1 培育箱：42℃±1℃、36℃±1℃.3.2 三角瓶，250mL.3.3 试管：15×150mm.3.4 灭菌平皿：直径90mm.3.5 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.6 显微镜.3.7 载玻片.3.8 接种针，接种环.3.9 电磁炉.3.10 高压灭菌器.4.1 SCDLP 液体培育基见总则中3.2.4.2 十六烷基三甲基溴化铵培育基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g琼脂 20g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min灭菌后，制成平板备用.4.3 乙酰胺培育基成分：硫酸镁（MgSO4.7H2琼脂 20g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂和酚红外，将别的成分加到蒸馏水中，加热溶解，调kPa (121℃15lb)20min高压灭菌后，制成平板备用.4.4 绿脓菌素测定用培育基成分：蛋白胨 20g硫酸钾 10g琼脂 18g甘油（化学纯） 10g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.4.5 明胶培育基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 5g明胶 120g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，直立制成高层备用.4.6 硝酸盐蛋白胨水培育基成分：蛋白胨 10g酵母浸膏 3g硝酸钾 2g亚硝酸钠 0.5g蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调kPa (115℃10 lb)20min高压灭菌后备用.4.7 平凡琼脂斜面培育基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.5.操纵步调5.1 增菌培育：取1：10样品浓缩液10mL加到90mLSCDLP液体培育基中，置36℃±1℃培育18h～24h.如有铜绿假单胞菌生长，培育液概况多有一层薄菌膜，培育液常呈黄绿色或蓝绿色.5.2 分离培育：从培育液的薄膜处挑取培育物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培育18h～24h.凡铜绿假单胞菌在此培育基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略在蔓延，概况潮湿，菌落呈灰白色，菌落四周培育基常扩散有水溶性色素，此培育基选择性强，大肠埃希氏菌不克不及生长，革兰氏阳性菌生长较差.在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培育基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃培育24h±2h，铜绿假单胞菌在此培育基上生长良好，菌落扁平，边沿不整，菌落四周培育基略带粉红色，别的菌落不生长.5.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶实验.5.4 氧化酶实验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸上，然后在其上滴加一新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶实验阳性；若培育物不变色，为氧化酶实验阴性.5.5 绿脓菌素实验：取可疑菌落2个～3个，分别接种在绿脓菌素测定培育基上，置36℃±1℃培育24h±2h,加入氯仿3mL～5mL,充分振荡使培育物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻.如下层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，暗示被检物中有绿脓菌素存在.5.6 硝酸盐还原产气实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培育物，接种在硝酸盐蛋白胨水培育基中，置36℃±1℃培育24h±2h,观察结果.凡在硝酸盐蛋白胨水培育基内的小倒管中有气体者，即阳性，标明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解发生氮气.5.7 明胶液化实验，取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培育物，穿刺接种在明胶培育基内，置36℃±1℃培育24h±2h,取出放冰箱10min～30min,如仍呈溶解状或概况溶解时即为明胶液化实验阳性；如凝结不溶者为阴性.5.8 42℃生长实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培育物，接种在平凡琼脂斜面培育基上，放在42℃±1℃培育箱中，培育24h～48h,铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不克不及生长.被检样品经增菌分离培育后，经证明为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素实验皆为阳性者，即可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素实验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长实验三者皆为阳性时，仍可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌.五、金黄色葡萄球菌本规范规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法.本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验.本规范采取下列定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状陈列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝结酶阳性.该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能惹起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症.3.1 显微镜.3.2 恒温培育箱：36℃±1℃.3.3 离心机.3.4 灭菌吸管，1mL、10mL.3.5 灭菌试管：15×150mm.3.6 载玻片.3.7 酒精灯.4.1 SCDLP液体培育基见总则中3.2.4.2 7.5%的氯化钠肉汤成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水加至 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min 高压灭菌. 4.3 Baird Parker 氏培育基成分：胰蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 1g丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g氯化锂（LiCl·6H2O） 5g琼脂 20g蒸馏水 950mL±增菌剂的配制：30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保管于冰箱内.制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃kPa (121℃15lb)高压灭菌15min.临用时加热溶化琼脂，每95mL加入预热至50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板.培育基应是致密不通明的.运用前在冰箱储存不得超出48h±2h.4.4 血琼脂培育基成分：养分琼脂 100mL脱纤维羊血（或兔血） 10mL制法：将养分琼脂加热消融，待冷至50℃左右无菌操纵加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用.4.5 甘露醇发酵培育基成分：蛋白胨 10g氯化钠 5g甘露醇 10g牛肉膏 5g0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min灭菌备用.4.6 兔（人）血浆制备kPa (121℃15lb)30min高压灭菌，1份加兔（人）全血4份，混匀静置；2000rpm～3000rpm离心3min～5min.血球下沉，取下面血浆.5.1 增菌：取1：10浓缩的样品接种到90mL SCDLP液体培育基中，置36℃±1℃培育箱，培育24h±2h.注：如无此培育基也可用7.5%氯化钠肉汤.5.2 分离：自上述增菌培育液中，取1～2接种环，划线接种在Baird Parker 氏培育基，如无此培育基也可划线接种到血琼脂平板，置36℃±1℃培育箱培育24h～48h.在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不通明，概况光滑，四周有溶血圈.在Baird Parker氏培育基上为圆形，光滑，凹陷，潮湿，直径2mm～3mm,颜色呈灰色到黑色，边沿为淡色，四周为一混浊带，在其外层有一通明带.用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度.偶尔会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及通明带.挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃培育24h±2h.μm～1μm.5.4 甘露醇发酵实验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培育基中，在培育基液面上加入2mm～3mm高的灭菌液体石蜡，置36℃±1℃培育箱培育24h±2h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸.5.5 血浆凝结酶实验：汲取1：4奇怪血浆0.5mL,放入灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉汤培育物0.5mL.混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半个小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性.同时以已知血浆凝结酶阳性和阴性菌株肉汤培育物及肉汤培育基各0.5mL,分别加入灭菌1：4血浆0.5mL,混匀，作为对照.凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝结酶实验阳性者，可陈述被检样品检出金黄色葡萄球菌.六、霉菌和酵母菌本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌的检验方法.本规范适用于各种化妆品中霉菌和酵母菌的计数.本规范采取下列定义霉菌和酵母菌数测定（Determination of molds and yeast count）是指化妆品检样在肯定条件下培育后，1g或1mL化妆品中所净化的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌净化程度及其一样平常卫生情况.本方法根据霉菌和酵母菌特有的形状和培育特性，在虎红培育基上，置28℃±2℃培育72h,计算所生长的霉菌和酵母菌数.3.1 培育箱：28℃±2℃.3.2 振荡器.3.3 天平.3.4 三角瓶，250mL.3.5 试管：15×150mm.3.6 平皿：直径9cm.3.7 吸管，1mL、10mL.3.8 量筒，200mL.3.9 酒精灯.3.10 高压灭菌器.4.1 生理盐水见总则中3.1.4.2 虎红（孟加拉红）培育基成分：蛋白胨 5g葡萄糖 10g磷酸二氢钾 1g硫酸镁（含7H2琼脂 20g1/3000虎红溶液（四氯四碘荧光素） 100mL蒸馏水 1000mL氯霉素 100mgkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌，另用大批乙醇溶解氯霉素，过滤溶解后加入培育基中，若无氯霉素，运用时每1000mL加链霉素30mg.5.1 样品浓缩见总则中供检样品的制备.5.2 取1：10、 1：100、 1：1000的检液各1mL分别注入灭菌平皿内，每个浓缩度各用2个平皿，注入消融并冷至45℃±1℃左右的虎红培育基，充分摇匀.凝结后，翻转平板，置28℃±1℃培育72h±2h,计数平板内生长的霉菌和酵母菌数.若有霉菌蔓延生长，为防止影响别的霉菌和酵母菌的计数时，于48h±2h应及时将此平板取出计数.5.3 计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个浓缩度的均匀菌落数.断定结果时，应选取菌落数在5个～50个范围之内的平皿计数，乘以浓缩倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数.别的范围内的菌落数陈述应参照菌落总数的陈述方法陈述之.5.4 每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)暗示.。
《化妆品微生物标准检验方法》GB-7918.1～5——87
一、总则General Principle1 范围本规范规定了化妆品微生物学检验总则。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存、供检样品制备。
2 仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶。
2.5 玻璃珠。
2.6 玻璃棒。
2.7 刻度吸管。
2.8 研钵。
2.9 均质器。
2.10 恒温水浴箱。
2.11 采样用具：不锈钢勺，剪刀，开罐器等。
3 培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000 mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌。
3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 2.5g卵磷脂1g吐温80 7g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3，分装，103.43kPa(15lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4灭菌吐温80。
4 样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量应适量增加，其总量应大于16g。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态，进口产品应为市售包装。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一份样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，应先做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用采样用具、器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
化妆品微生物学检验方法汇编
化妆品检验方法细菌总数的测定1方法提要细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。
化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理特性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h）生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的细菌总数。
本标准采用标准平板计数法。
2 培养基和试剂的配制2.1生理盐水称取8.5克氯化钠加入1000毫升纯水溶解后，分装到加玻璃珠的锥形瓶内，每瓶90毫升，121℃（15 lb）20分钟高压灭菌。
2.2卵磷脂、吐温-80营养琼脂培养基按成品培养基用法说明配制。
3.仪器3.1 锥形瓶3.2 量筒3.3 高压消毒锅3.4 试管3.5 灭菌平皿3.6 灭菌刻度吸管：10mL、2mL、1mL3.7 酒精灯3.8 恒温培养箱3.9 显微镜3.10 pH计4 操作步骤4.1 用灭菌吸管取1：10稀释的检样2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，使成1：100稀释液。
吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL，如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000，1：10000等，每种稀释度应更换1支吸管。
4.2 将融化并冷却至45-50℃的卵磷脂、吐温-80、营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15mL，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿，置37℃培养箱内培养48小时。
5 菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5~10的放大镜检查，以防遗漏，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时该平皿不宜计数。
化妆品微生物检验方法
一、总则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2.仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 琉璃棒。
2.7 刻度吸管，1mL、10mL。
2.8 研钵或均质器。
2.9 恒温水浴箱。
3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90 mL，103.43kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖1g吐温80 7g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43 kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温80。
4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
化妆品微生物检验方法
一、总则1、范围本规范规定了化妆品微生物检验得基本要求.本规范适用于化妆品样品得采集、保存及供检样品制备。
2、仪器与设备2、１天平。
2、2 高压灭菌器。
2、３振荡器。
２、4三角瓶,２５０mL。
2、５玻璃珠。
２、6 琉璃棒。
2、7刻度吸管，１ｍL、10mＬ.2、8 研钵或均质器。
2、９恒温水浴箱.３、培养基与试剂3、1 生理盐水成分：氯化钠8、5g蒸馏水加至100０ｍL溶解后,分装到加玻璃珠得三角瓶内，每瓶90 mL,1０3、43kPａ（121℃1５lb）2０min高压灭菌。
３、２SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾2、５g葡萄糖1g吐温80 ７g蒸馏水１000ｍL制法:先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后,再与其它成分混合,加热溶解，调pH为7、2~７、3分装，103、４３ｋPａ（1２１℃15lb)2０ｍｉn高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层得吐温80充分混合,冷却至２5℃左右使用.注：如无酪蛋白胨与大豆蛋白胨,也可用多胨代替。
3、３灭菌液体石蜡。
3、4 灭菌吐温80。
4、样品得采集及注意事项4、１所采集得样品，应具有代表性,一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量得包装单位.检验时，应分别从两个包装单位以上得样品中共取１0g或10mL。
包装量小于20g得样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4、2 供检验样品，应严格保持原有得包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开,防止样品被污染。
４、3 接到样品后,应立即登记,编写检验序号,并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处,不要冷藏或冷冻。
4、4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等,则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4、5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束,均须防止微生物得再污染与扩散,所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
化妆品微生物检验方法
化妆品微生物检验方法1.总大肠菌群检验法总大肠菌群检验法是一种常用的指示性检验方法。
它以大肠杆菌作为指示菌，通过检测大肠杆菌的数量来判断样品是否受到污染。
该方法根据不同化妆品的特点，选择适当的培养培养基，将样品在指定的培养条件下培养和孵育一段时间后，统计分析细菌的数量。
2.革兰氏染色法革兰氏染色法是一种常用的微生物鉴定方法。
它通过染色的方式将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，进而对细菌进行鉴定。
该方法可以直接观察细菌的形态和结构，从而判断样品中是否存在细菌污染。
3.真菌检验法真菌检验法用于检测样品中真菌的数量和种类。
常用的方法包括菌落计数法和荧光分离鉴定法。
菌落计数法是将样品在含有适当培养基的琼脂平板上均匀涂布，经过一段时间后，统计平板上真菌菌落的数量。
荧光分离鉴定法使用荧光染料染色，通过显微镜观察细菌形态和结构，从而确定真菌的种类。
4.抑制菌检验法抑制菌检验法用于检测样品中对细菌或真菌具有抑制作用的物质。
常用的方法包括抑菌圈法和最低抑菌浓度法。
抑菌圈法是将样品与含有细菌或真菌的琼脂平板接触，通过观察样品周围产生的抑菌圈直径来判断样品中的抑菌活性。
最低抑菌浓度法是通过连续稀释样品，将其与细菌或真菌接触，从而确定样品的最低抑菌浓度。
5.DNA分子检测法DNA分子检测法是一种高灵敏度和高特异性的微生物检测方法。
该方法通过提取样品中的DNA，利用PCR技术或基因芯片分析技术检测目标微生物的特异性基因序列，从而判断样品中是否存在目标微生物以及其数量。
总之，化妆品微生物检验方法的选择应该根据不同化妆品的特性和目的进行合理选择。
合理的微生物检验方法可有效确保化妆品的安全性和质量，保护消费者的健康。
化妆品微生物检验方法
8.5 化妆品微生物检验方法化妆品中，特别是一些高级的护肤膏等含有蛋白质、氨基酸、维生素以及各种植物的提取液等营养成分较高的物质，为霉菌、细菌等微生物的滋生、繁殖提供了良好的生长条件，影响化妆品的质量和并危害人体健康。
在国外，许多国家所制定的化妆品微生物控制标准相当严格。
欧美一些国家要求化妆品的杂菌数每克（或每毫升）控制在（100～1000）个，不允许有致病菌。
我国药品微生物检验法规定，乳剂或外用液体每克（或每毫升）含杂菌数按品种不同控制在（500～1000）个。
在此，主要讨论化妆品微生物检验时样品的采集，细菌总数测定，粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的测定。
8.5.1 化妆品微生物标准检验方法总则化妆品微生物标准检验方法总则按国家标准（GB 7918.1-87）执行，该总则提供了样品的采集及注意事项，供检样品的制备，不同类型的样品的检样制备的统一标准。
1．样品的采集及注意事项（1）所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10 g或10 mL；包装量小的样品，取样量可酌减。
（2）供检样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得启开，以防再污染。
（3）接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
（4）若只有一个样品，而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品作细菌检验，再将剩余样品作其它分析。
（5）如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出起该菌种及被检样品应保存一个月备查。
2．供检样品的制备（1）培养基和试剂1）生理盐水：称取8.5 g氯化钠溶解于1000 mL蒸馏水中，分装入加玻璃球的三角瓶中，每瓶90 mL，在0.1 MPa压强下高压灭菌20 min。
2）SCDLP液体培养基：配方如表8-14所示。
化妆品微生物检验方法
化妆品微生物检验方法化妆品微生物检验方法是保证化妆品质量和安全性的重要环节之一、微生物检验旨在检测化妆品中是否存在致病或有害微生物，并评估其对人体的危害程度。
常用的化妆品微生物检验方法包括总生菌数、霉菌与酵母菌数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等指标的检测。
首先，样品的制备过程中需要选择适当的培养基和增菌条件。
通常将适量的化妆品样品加入到无菌的苗条瓶或小瓶中，加入适量的培养基并混匀。
对于含有高浓度防腐剂或抗菌剂的化妆品样品，还需要将样品进行稀释以降低防腐剂的作用。
然后，将样品进行摇匀或振荡，以保证样品的均匀分布。
接下来，进行微生物的富集。
一般来说，化妆品样品中的微生物数量较少，因此需要对样品进行富集处理以增加微生物的检出率。
常用的富集方法包括摇床富集法、过滤富集法、以及使用适当的抑菌剂来抑制防腐剂对微生物的影响。
然后，进行微生物的分离。
富集样品后，将样品取一定量均匀涂布在适当的培养基上，并进行培养。
通过分离纯菌的方式，可以获得单一的微生物菌株，从而进行后续的鉴定和计数。
最后，进行微生物菌株的鉴定和计数。
常用的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性检测、API试纸和分子生物学方法等。
形态学观察是最常用的方法，通过观察菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度等特征来初步鉴定细菌的种属。
生理生化特性检测则是通过检测菌落的气味、产酶和耐受性等特征来进一步鉴定菌株。
API试纸是一种常用的微生物鉴定试剂，可以根据菌株对不同化学物质的反应来判断其种属。
分子生物学方法可以根据菌株的基因序列进行鉴定，如16SrRNA基因测序等。
微生物计数则可以通过在适当的培养基上进行菌落计数或数量化培养等方法进行。
综上所述，化妆品微生物检验方法是确保化妆品安全性和质量的重要环节。
通过适当的样品制备、微生物富集、分离和鉴定等步骤，可以准确评估化妆品中的微生物负荷，从而为化妆品行业的发展提供保障。
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一、总则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2.仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 琉璃棒。
2.7 刻度吸管，1mL、10mL。
2.8 研钵或均质器。
2.9 恒温水浴箱。
3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90 mL，103.43kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖1g吐温80 7g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43 kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温80。
4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
4.6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。
5.供检样品的制备5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍稀释法进行。
如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1：10检液。
5.1.2 油性液体样品，取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80,在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液。
5.3 固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液。
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加入10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min。
二、菌落总数1.范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。
本规范适用于化妆品菌落总数的测定。
2.定义本规范采用下列定义菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等），1g(1mL)检样中所含菌落的总数。
所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生总评价的综合依据。
3.仪器和设备3.1 三角瓶，250mL。
3.2 量筒，200mL。
3.3 pH计或精密pH试纸。
3.4 高压灭菌器。
3.5 试管：15×150mm。
3.6 灭菌平皿：直径9cm。
3.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。
3.8 酒精灯。
3.9 恒温培养箱：36℃±1℃。
3.10 放大镜。
4.培养基和试剂4.1 生理盐水：见总则中3.1。
4.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基4.2.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g卵磷脂1g吐温80 7g蒸馏水1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.1～7.4,加入琼脂，103.43kPa (121℃15 lb)20min 高压灭菌，储存于冷暗处备用。
4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：TTC 0.5g蒸馏水1000mL溶解后过滤，103.43kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。
5.操作步骤5.1 用灭菌吸管吸取1：10稀释的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
另取1mL注入到9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液。
吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000,1：10000，……等，每种稀释度应更换1支吸管。
5.2 将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15 mL,随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h。
另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，为空白对照。
5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL 0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
6．菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍的放大镜检查，以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后，求出同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2,以代表全皿菌落数。
7.菌落计数及报告方法7.1 首先选取平均菌落数在30个～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1中例1）。
7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2,应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表1中例2及例3）。
7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例4）。
7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例5）。
7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30个～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例6）。
7.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10 CFU。
7.7 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。
为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见表1报告方式栏）。
在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表1 细菌计数结果及报告方式*CFU：菌落形成单位。
三、粪大肠菌群1.范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。
本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。
2.定义本规范采用下列定义粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44℃±0.5℃培养24h～48h 能发酵乳糖产酸并产气。
该菌直接来自粪便，是重要的卫生指标菌。
3.仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
3.2 温度计。
3.3 显微镜。
3.4 载玻片。
3.5 接种环。
3.6 电磁炉。
3.7 三角瓶，250mL。
3.8 试管：15×150mm。
3.9 小倒管。
3.10 pH计或pH试纸。
3.11 高压灭菌器。
3.12 灭菌吸管，10mL、1mL。
3.13 灭菌平皿：直径90mm。
4.培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基成分：蛋白胨40g猪胆盐10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐温80 14g蒸馏水1000mL制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。
将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。
68.95kPa (115℃10 lb)20min 高压灭菌。
4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2%伊红水溶液20mL0.5%美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mL制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。
再以蒸馏水补足至1000mL。
校正pH值为7.2～7.4,分装于三角瓶内，103.43kPa (121℃15 lb)15min高压灭菌备用。
临用时加入乳糖并加热融化琼脂。
冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。
倾注平皿备用。
4.3 蛋白胨水（做靛基质试验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2.分装小试管，103.43kPa (121℃15 lb)15min高压灭菌。
4.4 靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。
沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。
阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸馏水加至300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。