PCR原理及各类PCR仪
四种常见PCR仪的区别及运用-科邦实验室-2020.6.24
四种常见PCR仪的区别及运用PCR扩增仪（俗称PCR仪）PCR：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
1). 普通PCR仪（2万以下，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。
如果要做不同的退火温度需要多次运行。
主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。
如:启步BSW-2P,BSW-3P,BSW-6P-I/II ,ABI 2720型2). 梯度PCR仪（2万-8万，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。
因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。
用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。
PCR仪的种类
PCR仪的种类1. 实时定量PCR仪实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称实时定量PCR）是一种用于快速、敏感且准确测定DNA、RNA拷贝数目的方法。
实时定量PCR仪是进行实时定量PCR实验的关键设备之一。
实时定量PCR仪的主要特点是能够对PCR反应过程中产生的荧光信号进行即时检测和分析，从而实现实时监测PCR反应的进程，并测定样品中目标序列的拷贝数。
实时定量PCR仪的应用非常广泛，包括基因表达检测、病原体检测、单核苷酸多态性分析等。
其高灵敏度、高特异性以及广泛的应用领域使其成为现代分子生物学和遗传学研究的重要工具。
2. 普通PCR仪普通PCR仪是进行普通聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）实验的基本设备。
普通PCR仪可以进行常规PCR实验，即通过PCR反应在体外扩增目标DNA片段。
普通PCR仪的特点是温控系统可以实现快速、精确的温度调节，从而使PCR反应在不同温度下的环境条件得以满足。
普通PCR仪的操作简单、成本较低，适用于常规PCR 实验的需求。
普通PCR仪的应用广泛，包括基因克隆、DNA测序、基因检测等。
它已成为分子生物学、医学和生物技术等领域中的一种基础设备。
3. 数字PCR仪数字PCR仪是一种相对较新的PCR仪器，它采用数字分析的方法对PCR产物进行定量，具有极高的准确性和可靠性。
数字PCR仪的工作原理是将PCR反应体系分成数百、甚至上千个微小反应体，从而形成多个独立的PCR反应。
每个微小反应体内含有目标序列与参考序列，通过数百或数千个微小反应的计数结果进行定量分析。
这种方法可以极大地降低PCR反应中的误差，提高PCR反应的准确性。
数字PCR仪的应用主要集中在绝对定量PCR、稀释样品的精确定量、病原体检测等领域。
其高准确性和可靠性使其在遗传学研究和临床诊断中得到广泛应用。
PCR Protocol
聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，通过特定的引物和DNA聚合酶，将特定的DNA片段在体外进行快速、特异的扩增。
以下是PCR的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、PCR的原理PCR技术的基本原理是通过对DNA的双链进行特异性解旋，然后在DNA聚合酶的作用下，以解开的每一条单链为模板，将特定的引物与单链的5’端和3’端结合，形成起始复合物。
在适宜的温度和条件下，DNA聚合酶将从引物3’端开始延伸DNA链，并通过反复变性-延伸循环，实现DNA片段指数级扩增。
二、所需试剂和耗材1.引物：用于与模板DNA结合，指示DNA聚合酶从何位置开始延伸。
引物可以是人工合成的寡核苷酸，也可以是从RNA或天然DNA中提取的。
2.DNA模板：被扩增的DNA片段的原始双链分子。
3.DNA聚合酶：催化DNA复制的酶，如Taq DNA聚合酶。
4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
5.缓冲液：调节反应液的pH值，一般含有Mg2+离子以及其他辅助因子。
6.耐高温的DNA分离酶抑制剂：防止在高温下DNA被破坏。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
三、实验仪器1.基因扩增仪（PCR仪）：用于完成PCR的变性-延伸循环。
2.微量移液器：用于精确添加PCR反应液。
3.离心管：用于混合和离心PCR反应液。
4.水浴锅：用于PCR反应液保温。
5.电泳仪和电泳槽：用于分析扩增的DNA片段。
6.显微镜：观察细胞和组织样品。
7.分光光度计：用于测量DNA和RNA的浓度。
四、准备工作1.了解PCR的基本原理和步骤。
2.设计和制备引物：根据目的基因序列设计特异性引物。
3.准备基因组DNA或cDNA：从细胞或组织中提取基因组DNA或通过反转录制备cDNA。
4.缓冲液和其他试剂的准备：根据PCR试剂清单准备所有必需的试剂。
PCR原理及各类PCR仪
PCR原理及各类PCR仪PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种通过扩增DNA片段的技术。
PCR的基本原理是利用DNA聚合酶酶活性，在适当的条件下，通过DNA的复制和扩增来获得大量的DNA片段。
PCR技术已经广泛应用于医学、疾病诊断、基因工程和进化研究等领域。
PCR基本原理：PCR基本原理是在一系列温度变化的条件下，通过DNA引物与模板DNA相互结合和分离，并通过DNA聚合酶的作用逐步扩增产生大量目的DNA片段。
PCR步骤：1. 反应体系组成：反应体系包含DNA模板、引物（primer）、dNTP （脱氧核苷三磷酸）、Mg2+离子、缓冲液和DNA聚合酶等成分。
2. Denaturation（变性）：将反应体系加热至95°C，使得DNA双链变为两条单链DNA。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物与模板DNA结合的温度，引物与DNA模板互补序列结合形成DNA双链。
4. Extension（延伸）：将反应体系升温至DNA聚合酶最适温度，DNA聚合酶在引物的作用下，在引物上逐步延伸合成新的DNA链。
PCR类别：1.常规PCR：常规PCR是最简单和常用的PCR方法，可用于扩增目标DNA区域。
2.实时定量PCR（qPCR）：qPCR是一种测定PCR产物数量的方法，可以用于定量DNA或RNA浓度，以及检测基因表达水平。
3.逆转录PCR（RT-PCR）：RT-PCR将RNA反转录为cDNA，然后再进行PCR扩增，用于检测基因表达。
4.数字PCR（dPCR）：dPCR是使用分子方法计算DNA模板的浓度和扩增产物的绝对数量的技术。
5.巢式PCR：巢式PCR是在两步PCR中进行的，第一步是较高的退火温度安排，用于生成内部引物所需的DNA片段，第二步是较低的温度安排，用于增加PCR产物的数量。
6. 长PCR：长PCR用于扩增较大的DNA片段，通常超过5 kb，需要更长的扩增时间和更大的反应体积。
定量PCR原理及PCR仪光学原理
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针) Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye:
ROX
- passive internal reference for signal normalisation - allows relative (not absolute) fluorescence to be measured - critical for precision
Q
R
Q
AGGCCTTGAGAGATAT MGB
(minor groove binder)
R
提高探针Tm值
AGGCCTTGAQGAGATAT |||||||||||||||| GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
27
3'
5'
典型的PCR分4个阶段
平台期 线性增长期 指数增长期 基线期
pcr仪的工作原理
pcr仪的工作原理PCR（聚合酶链式反应）仪是一种用于进行聚合酶链式反应的设备，其工作原理涉及温度控制、荧光探测等关键技术。
以下是PCR仪的基本工作原理：1. 变温块：PCR仪中的关键部分是一个能够控制温度的变温块。
这个块通常由热电偶或其他传感器探测样品的温度，然后根据PCR程序的要求，通过电加热或制冷来快速而精确地调整温度。
2. PCR程序：PCR通常包括一系列的温度循环，每个循环中都有不同的温度阶段。
最基本的PCR程序包括以下三个阶段：-变性（Denaturation）：在较高的温度（通常为94-98摄氏度），DNA的双链会分离为两条单链。
-退火（Annealing）：在较低的温度（通常为50-65摄氏度），引物（PCR反应中的引物是DNA链上的短序列）结合到目标序列的末端，形成引物-模板DNA复合物。
-延伸（Extension）：在中间的温度（通常为72摄氏度），DNA聚合酶沿着模板DNA 合成新的DNA链。
这是PCR的关键步骤，因为它会在目标序列的每个引物结合点上生成新的DNA。
3. 荧光探测：PCR仪中通常使用荧光探测系统来检测PCR反应的进程。
这可以通过引物或DNA与荧光染料结合，形成荧光信号。
在PCR的每一个周期，荧光信号都会被记录下来，从而能够实时监测PCR反应的进行。
4. 热盖：PCR仪还配备了一个热盖，用于避免PCR反应中的蒸发，并确保反应混合物的均匀受热。
总体而言，PCR仪通过精确控制温度循环，使PCR反应在不同温度下的三个步骤（变性、退火、延伸）重复进行，从而在短时间内扩增DNA。
荧光探测系统实时监测PCR的进程，使其成为一种高效、快速、精确的DNA扩增技术。
PCR仪
03
PCR仪相关配套仪器设备
仪器设备 PCR仪 荧光定量PCR仪 核酸蛋白分析仪 电炉/微波炉 电泳仪/电泳槽/电泳仪电源 凝胶成像系统 主要用途 用于基因扩增 用于基因扩增与数据分析 用于DNA浓度和纯度的测定 用于琼脂糖凝胶等的加热熔化。 用于PCR扩增后电泳分离纯化 用于电泳结果的观察、分析。 用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组 中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断 等方面。（分子生物学/临床诊断） 用于PCR科隆测序验证、突变体检测、新基因测 序、全基因组测序、系统发育及物种鉴定、个体 识别 亲缘鉴定、SPN关联分析、基因诊断等。 用于实验室废弃物等的灭菌。
01
基础知识
基础知识
一.PCR反应成分（PCR反应体系)：（五要素） 1.模板DNA：含有需要扩增的DNA片段。 2.引物：决定了需要扩增的起始和终止位置。 3.脱氧核糖三磷酸（dNTP）：4种脱氧核糖核酸，用于构造新的互补 链。 4.耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）：复制需要扩增的区域。 5.Mg2+:用于激活DNA聚合酶的活性中心。
基础知识
实验方法：
03
荧光定量PCR仪应用（食品、农业）
基础知识
实验：水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法 主要仪器： 实时荧光定量PCR仪；天平；冷冻研磨仪；消毒灭菌锅；制冰机；核酸蛋白分析仪； 高速冷冻离心机；台式小型离心机；Mini个人离心机；低温冰箱；旋涡振荡器；金属 浴；微量移液器。 实验流程： 制样
主要用于研究未知DNA退火温度的扩增。在不设置梯 一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度 度的情况下亦可当做普通的PCR用。主要：科研机构， 条件(通常12种温度梯度)。 医学临床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。 主要是应用对细胞或组织内的DNA片段进行原位 扩增分析-即定位分析。无需将细胞破碎提取 主要用于医学临床研究，如癌细胞等。 DNA，细胞内有DNA酶的作用扩增受到一定的影 响，使用不是很普遍。
pcr扩增仪的原理特点应用论文
PCR扩增仪的原理特点应用论文引言PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增技术是一种基于酶的体外DNA合成技术，是分子生物学领域中最重要的实验方法之一。
PCR扩增仪作为PCR技术的关键设备，在分子生物学和遗传学研究中发挥着重要作用。
本文将介绍PCR扩增仪的原理、特点和应用。
PCR扩增仪的原理PCR扩增仪基于聚合酶链式反应原理实现DNA的体外扩增。
聚合酶链式反应是一种无需模板DNA的体外复制方法，能够通过酶的作用，扩增特定的DNA序列。
PCR扩增仪主要包括以下三个步骤： 1. 变性（Denaturation）：将DNA模板加热至高温，使双链DNA解链成单链； 2. 退火（Annealing）：降低温度，使引物与模板DNA的单链进行互补结合； 3. 延伸（Extension）：在合适的温度下，聚合酶作用下，引物在模板DNA上延伸合成新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，可以在短时间内扩增特定DNA序列。
PCR扩增仪通过精确控制温度和时间，实现PCR扩增反应的自动化、高效化。
PCR扩增仪的特点PCR扩增仪具有以下特点： - 精确控制温度：PCR扩增仪能够精确控制反应体系的温度，在不同步骤之间快速切换，满足PCR反应的温度要求。
- 可编程控制：PCR扩增仪通常配备可编程控制器，用户可以根据需要设置不同的温度和时间参数，满足不同扩增反应的要求。
- 高温均匀性：PCR扩增仪内部采用特殊的加热系统和温度传感器，能够实现高温均匀性，确保PCR反应的稳定性和可靠性。
- 自动化操作：PCR扩增仪具有自动化的操作功能，可以自动完成变性、退火、延伸等步骤，无需手动干预，提高实验效率。
- 安全性：PCR扩增仪在设计上考虑了安全因素，如过高温度时的自动停止功能，防止设备和实验物品损坏。
- 小型便携：PCR扩增仪通常具有小型便携的特点，方便携带和移动，适用于实验室和野外等不同环境。
PCR扩增仪的应用PCR扩增仪在分子生物学和遗传学研究中具有广泛的应用。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。
自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。
通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。
2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。
三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。
2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。
六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。
2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。
3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。
4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。
5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。
七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。
可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。
定量PCR原理及PCR仪光学原理
定量PCR原理及PCR仪光学原理1.荧光染料法：在PCR反应混合液中添加荧光染料，该染料只与双链PCR产物结合并产生荧光信号，因此只有在扩增过程中产生双链PCR产物时才会有荧光发光。
PCR反应过程中，荧光信号会随着扩增产物的积累而增加。
可以通过荧光强度与PCR循环数的关系来计算出初始模板的初始数量。
2.探针法：在PCR反应中加入探针，该探针通常包含两个部分：荧光染料基团和辅助基团。
辅助基团可以竞争性结合PCR产物，从而导致荧光信号减弱或熄灭。
当PCR过程中产生PCR产物时，探针会被酶水解并释放出荧光染料基团，从而导致荧光信号增强。
通过测量荧光信号的变化，可以测量PCR 产物的数量。
PCR仪光学原理：PCR仪是用于定量PCR实验的专用仪器，它具有特殊的光学系统来测量荧光信号的强度。
PCR仪的光学原理通常基于光衰减原理。
PCR仪中使用的荧光染料或探针一般会发出荧光信号，该信号在PCR过程中会通过光学系统进行收集和测量。
PCR仪的光学系统一般包括以下几个组件：1.光源：PCR仪通常使用特定波长的光源来激发荧光信号的发生。
常见的光源有LED或氙气灯。
2.滤光片：滤光片用于选择特定波长的荧光信号传递到探测器，并阻挡其他波长。
滤光片通常由凹凸面组成，以控制特定光线的传播方向和传播方式。
3.检测器：检测器用于测量荧光信号的强度。
常见的检测器有光电二极管（photodiodes）或光电倍增管（photomultiplier tubes），它们可以将荧光信号转化为电信号。
4.放大器和转换器：放大器用于增强电信号的强度，并将其转换为数字信号。
5.软件和分析系统：PCR仪通常配备专门的软件和分析系统，用于处理和分析测量的数据。
这些软件可以计算出初始模板的初始数量，并生成相应的曲线和图表。
总结：定量PCR是一种用于测量DNA或RNA在样本中的定量浓度的技术，依赖于PCR过程中的荧光信号的监测。
荧光染料法和探针法是常用的定量PCR方法。
PCR仪的原理和使用
PCR仪的原理和使用PCR（聚合酶链反应）仪是一种用于扩增和复制DNA序列的实验仪器。
PCR反应是一种体外的快速扩增DNA序列的方法，其原理是在适当的反应条件下，使用DNA聚合酶及其引物以及模板DNA，通过反复进行三步循环的温度变化（变性、退火、扩增），最终可以快速扩增目标DNA。
PCR仪是为了实现PCR反应而专门设计的仪器，它可以精确控制反应体系的温度和时间。
PCR仪的主要组成部分包括温控模块、光学检测模块、控制模块和显示模块。
温控模块负责精确控制反应体系的温度，通常由Peltier元件和温控系统组成。
光学检测模块用于检测PCR反应过程中产生的荧光信号，通常采用光电二极管或光电倍增管等光电检测器件进行信号检测。
控制模块用于控制PCR反应的参数，如温度、时间等，通常由控制电路和软件程序组成。
显示模块用于实时显示PCR反应的结果，通常采用液晶显示屏或数码显示器。
1.准备反应体系：准备PCR反应所需的试剂和试管，如模板DNA、引物、dNTPs等。
根据实验需求确定反应体系的配比和容量。
2.设定PCR程序：在PCR仪的控制模块中设定PCR反应的程序，包括变性温度、变性时间、退火温度、退火时间和扩增温度等参数。
根据模板DNA的碱基序列和引物设计合理的PCR程序。
3.装载反应体系：将预先配制好的PCR反应体系装入PCR管或PCR片中，确保反应体系的充分混匀和无气泡。
4.温度调节：将装载好的PCR反应体系放入PCR仪中，并通过温控模块将温度快速升至设定的变性温度，保持一段时间进行DNA的变性。
5.引物退火：将温度降至设定的退火温度，以使引物与模板DNA结合。
通常，引物的退火温度低于模板DNA的熔解温度，以保证引物与DNA的特异性结合。
6.DNA扩增：将温度升至设定的扩增温度，此时DNA聚合酶开始工作，引物在模板DNA上进行扩增反应。
在每个PCR循环中，DNA的复制数量将翻倍。
7.反复循环：根据设定的PCR程序，反复进行温度变化循环，以使DNA的扩增倍数不断增加。
PCR仪原理及其应用
多组学分析
03
结合多种技术手段，实现多组学（如基因组、转录组和蛋白质
组）分析，为科学研究提供更全面的数据。
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准备阶段
01
02
03
仪器准备
确保PCR仪处于良好工作 状态，检查仪器是否清洁， 确保没有残留物。
试剂准备
根据实验需求，准备足够 的PCR反应试剂，包括 DNA模板、引物、dNTPs 和Taq酶等。
样品准备
将待检测的样品进行处理， 提取出所需的DNA片段， 并进行纯化。
实验阶段
01
PCR循环
按照设定的程序，在PCR仪中进行DNA扩增。通常包括变性、退火、延
pcr仪原理及其应用
目录
• pcr仪原理 • pcr仪的应用 • pcr仪操作流程 • pcr仪的优缺点 • pcr仪的发展趋势与展望
01 pcr仪原理
pcr技术概述
聚合酶链式反应（PCR）
一种在体外快速、特异地扩增DNA片段的分子生物学技术。
发明者
凯利·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明。
通过特定的引物和酶，PCR技术能够特异性 地扩增目标DNA或RNA片段，避免非特异 性扩增，提高检测准确性。
可重复性
自动化
PCR技术具有很高的可重复性，使得实验结 果更加可靠，并且可以进行大规模的实验 操作。
现代PCR仪通常都具有很高的自动化程度， 能够快速、准确地完成实验操作，减少人 为误差。
缺点
依据。
其他领域应用
环境监测与污染控制
食品工业
PCR仪可用于检测环境中的微生物和 污染物，为环境监测和污染控制提供 技术支持。
pcr仪的原理应用及发展趋势
PCR仪的原理应用及发展趋势一、PCR技术简介PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA序列的技术。
它通过重复序列的循环反应，在体外复制并扩增特定的DNA片段。
PCR技术是分子生物学领域中非常重要的工具，广泛应用于基因分型、疾病诊断、基因工程等领域。
二、PCR仪的原理PCR仪是PCR技术的重要设备，它通过控制温度和时间来实现PCR反应的各个步骤。
PCR仪主要由加热模块、温度控制模块和检测模块组成。
1.加热模块：PCR仪中的加热模块用于控制反应液的温度。
其工作原理是通过Peltier元件、热电偶和制冷装置等组件来实现。
2.温度控制模块：PCR反应需要经历一系列的温度变化，如变性、退火和延伸等步骤。
温度控制模块通过精确控制加热模块的温度，使PCR反应能够按照设定的步骤进行。
3.检测模块：PCR反应的结果需要进行检测和分析。
检测模块通常采用荧光检测技术或者电导率检测技术来实现PCR产物的定量和分析。
三、PCR技术的应用PCR技术的应用非常广泛，以下是一些主要领域的应用：•分子生物学研究：PCR技术可以用于在DNA水平上研究基因的表达、突变和功能等。
•医学诊断：PCR技术可以用于检测疾病相关基因的突变、病原体的检测和诊断等。
•法医学：PCR技术可以用于法医学领域的DNA分型、个体识别和犯罪现场物证鉴定等。
•基因工程：PCR技术可以用于构建重组DNA、基因克隆和基因编辑等。
四、PCR技术的发展趋势PCR技术在过去几十年中发展迅速，未来的发展趋势可以预见：1.快速PCR技术：传统PCR技术的一个瓶颈是反应时间较长，未来的发展方向之一是加快PCR反应速度，实现快速扩增。
2.高通量PCR技术：随着测序技术的快速发展，对PCR反应产物的高通量测序需求也在增加。
未来的PCR仪将更加关注样品处理的自动化和高通量化。
3.实时PCR技术的发展：实时PCR技术可以实时监测PCR反应的进程，同时具备高灵敏度和高特异性。
未来的PCR仪将更加注重实时PCR技术的发展和应用。
PCR仪简介
原理
经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或 包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用 基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体 做驱动力，发射出微弹与DNA的复合体， 击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞 壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸 附于微弹上的外源DNA导入细胞或原生质 体，获得整合与表达的目的。微弹复合体 对受体细胞造成的损伤可以修复。
PCR的反应包括三个主要步骤
分别是： 1.Denaturation 2.Annealingofprimers 3.Extensionofprimers 所谓Denaturing乃是将DNA加热（至90~95℃）变 性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制 的模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度 下（冷却至55~60℃）附着于模板DNA两端。最后 在DNA聚合酶e.g.Taq-polymerase的作用下（加热 至70~75℃）进行引物的延长Extensionofprimers 及另一股的合成。
（二）基因枪在植物基因转化中的 应用
目前，农作物基因工程正进入一个飞速发展的 时期，越来越多的转基因植物和产品进入市场。 不但可以利用基因枪技术种植具有特定农艺性 状（如抗病、抗寒、抗旱。抗涝、抗虫、耐盐、 耐药等）以及高质量食品（高蛋白、高油酸、 含维生素等）的作物，而且也可以利用该技术 来开发和利用具有特定用途（如生物制药）的 植物。总之，有了这种高效的转化技术，作物 复杂的生理生化性状等可望得到进一步的改良。
枪头种类
枪头
有芯
无芯
有芯:适合初学者使用，不易污
染移液器，但是不易清洗，只能 用紫外线杀菌，如果用高温灭菌 会导致变形
无芯：适合使用熟练者，易清洗，
PCR扩增仪
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2.梯度PCR仪
一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度 P通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而 一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。用于研究未知DNA退火温度的扩增， 这样节约成本的同时也节约了时间。梯度PCR仪在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。主要应用于科研、 教学机构。
产品分类
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量 PCR仪四类。
1.普通PCR仪
一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度 需要多次运行。主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、 检验检疫等机构。
PCR扩增仪
pcr扩增仪
01 发展历史
03 工作原理
目录
02 基本构造 04 PCR的反应动力学
目录
05 标准的PCR反应体系
07 产品分类
06 PCR的反应条件 08 工作环境
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中， 例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
基本构造
PCR扩增仪通常由热盖部件、热循环部件、传动部件、控制部件和电源部件等部分组成 。 PCR扩增仪结构示意图
工作原理
2.模板DNA与引物 的退火(复性)
PCR仪原理及其应用
PCR仪原理及其应用PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是通过反复进行一系列连接、断裂和复制DNA链的循环反应来扩增特定DNA片段。
PCR仪是PCR技术的重要工具，用于控制反应温度并监测反应进程。
PCR仪的工作原理:PCR仪利用热循环反应的原理进行扩增，一般包括三个温度阶段：变性、退火和延伸。
PCR仪通过一个可以精确控制温度的热噶尔块（或反应管）来实现这三个阶段。
1. 变性（Denaturation）阶段：通常在94-98°C条件下，DNA双链被热分离成两条单链。
2. 退火（Annealing）阶段：降低温度到50-65°C，引入一小段兼容的DNA引物（或寡核苷酸序列），它们会与目标DNA序列的两端互补结合。
3. 延伸（Extension）阶段：加入DNA聚合酶和适于酶催化的延伸条件（一般为60-75°C），让DNA聚合酶沿引物向3'方向合成新的DNA链。
这三个阶段循环进行，每个循环使DNA的数量翻倍，从而扩增DNA片段。
PCR仪的应用：PCR技术在分子生物学和医学领域具有广泛的应用。
1.基因检测和诊断：PCR可用于快速检测病原体、确定DNA序列、检测遗传突变等。
其敏感性和特异性使其成为潜在的遗传病诊断、药物靶点发现和个体化医疗的基础。
2.DNA克隆：PCR可用于扩增目标DNA片段，使其能够被进一步用于DNA测序、基因克隆、构建表达载体等。
3.疾病研究：PCR可用于检测和研究与疾病相关的基因突变，例如癌症、遗传性疾病等。
4.法医学：PCR可用于犯罪现场的DNA分析，例如确定嫌疑人的身份、进行亲子鉴定等。
5.环境监测：PCR可用于监测环境中特殊微生物物种的存在和丰度。
6.古DNA研究：PCR可用于从古DNA样本中扩增特定片段，以研究古生物学、人类进化等领域。
7.转基因生物检测：PCR可用于检测和鉴定转基因作物，判断食品和环境中是否存在未经批准的转基因生物。
PCR仪的分类复习进程
P C R仪的分类1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA 聚合酶以及合适的缓冲液体系。
PCR反应过程有以下3个步骤：①变性。
将反应体系混合物加热到94 ℃，维持较短时间（大约15 s-30 s），使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
②退火。
将反应体系冷却至特定的温度（引物的TM值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板引物复合物。
③延伸。
将反应体系的温度提高到72 ℃并维持一段时间，引物在耐热聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以4种单核苷酸（dNTP）作为底物合成新的DNA 链。
以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。
如此循环数十次，从而使目的基因得到指数级扩增，达到检测或获取基因的目的。
2 PCR仪的分类根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR 仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。
2.1普通PCR仪一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。
如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。
主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。
主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。
2.2 梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。
因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。
主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。
在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。
真正的梯度，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。
PCR技术及PCR仪资料
PCR的发展史
n 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； n 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，
只用一个循环； n 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的
第一个PCR片断； n 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论
n Tth DNA聚合酶
(Thermus thermophilus，Toyobo)
n Pfu DNA聚合酶
（Pyrococcus furiosus，Stratagene）
Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs）
n Tfl DNA聚合酶
（Thermus flavus，Promega)
n Tli DNA聚合酶
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
n 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
n 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
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Stratagene： MX3000P、MX3005P；
Roche：LightCycler 480、LightCycler2.0、LightCycler Nano； Eppendorf ：Masercycler；
数字PCR
数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子绝对定量技 术。相较于荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA 分子的个数，是对起始样品的绝对定量。 应用： 1、绝对定量 2、稀有突变检测（传染病研究如HIV） 3、转基因检测 4、环境样本检测 5、单细胞基因表达 6、病毒载量鉴定
基团，PCR反应过程中，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对起始模板进行定量分析的方法。 目的：获得初始模板DNA的浓度。
荧光定量PCR仪的关键是温控和荧光激发、检 测系统！
如何定量？
Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进 入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。
PCR原理及各类PCR仪
PCR原理
PCR全称是Polymerase Chain Reaction，即聚合酶 链式反应，是一种用于体外扩增特定的DNA片段的 分子生物学技术，PCR的最大特点，是能将微量的 DNA通过复制大幅增加。
PCR技术发展历程
普通PCR（梯度） 荧光定量PCR 数字PCR
定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光
达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性
关系，根据样品扩增达 到域值的循环数就可计 算出样品中所含的模板 量
1、染料法 SYBR Green 1 染料只有和双 链DNA结合后才发荧光
荧光定量PCR两种
2、探针法
普通PCR（梯度）
简单进行DNA复制扩增，然后可用电泳或者紫外分光光度计 进行扩增产物的检测。 目的：大量获得复制的DNA产物
普通PCR仪（梯度PCR仪）其实就是一台温控仪！
关键部件是温控模块！
PCR反应图解和要素
要素 1、模板DNA 2、dNTP 3、Taq酶 4、引物 5、精确的变化的温度
市场上主要的品牌和产品
AB：2720、9700、ProFlex、Veriti Bio-Rad：MJ Mini、MyCycler、PTC200、 PTC240、C1000、S1000 Eppendorf：Mastercycler pro S/pro/pro 384
荧光定量PCR
荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光
*8 其他要求：近5年内浙江省定量PCR（须为96孔板标准型配置），用户不少于100个，提 供详细清单。
市场上主要的品牌和产品
ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、 StepOne、PRISM StepOne； 2015年新发产品：7300Plus！！ BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNA Engine Opticon 2、 Chromo4、MiniOpticon；
数字PCR原理
一、油包水法 代表品牌：Bio-Rad（QX100、QX200）、Raindance （Raindrop） 使用成本：RainDance一个样本反应30-40美元
数字PCR原理
二、芯片法 代表品牌：AB（ QuantStudio 3D ） 使用成本：一个反应10美元（芯片+耗材）
PCR仪三种控温方法的区别
（CALCULATED、BLOCK、PROBE）
以bio-rad的 PCT-200型PCR仪为例：
A） 计算控制（ calculated ） 计算控制在运行大多数程序中是最好的温度控制方法，具有较好 的温度一致性、可靠性。用计算控制时，仪器通过对样品的管子或玻 片热传导的速度和样品体积进行模块温度估算（当运行程序时，这些 样品信息都会显示）。因为这种估算是根据已知容量和热力学的规律， 所以温度比模块或探针控制更加精确。运行计算控制能缩短实验时 间，简短的程序操作能保护酶的活性并减少引物的损失。 B） 模块控制（ block ） 模块控制与计算控制精度相比较低。在模块控制下，样品温度通 常是在模块后才到达设置的温度。这段延迟时间主要是因为管子的类 型和样品体积引起的。 C） 探针控制（ probe ） 通常，探针控制可用于不同的环境中，但是它需要小心使用。探 针不能用于微型板和玻片。
衡量普通PCR仪的参数 （以THERMO的ARKTIK为例）
样品模块规格：96×0.2ml、384×0.03ml、双48孔×0.2ml 温度梯度范围：1-30℃ 升降温速率：>3℃/s 温度均一性：±0.4℃（95℃时） 温度精确性度： ±0.3℃ 温控范围：4-99.9℃ 热盖温控范围：30-110℃可调 用户界面：反应曲线图显示 尺寸 重量 电压 数据交换（USB接口） 保质期
视频资料—QUANTSTUDIO™3D 数字PRC系统
/life/index.html
2.5 检测性能 2.5.1 检测灵敏度：能检测到≤10个拷贝数的模板，置信度99.7% 2.5.2 线性范围：109以上 2.5.3 检测分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷贝 数的差异 2.6 分析功能 2.6.1 定量量型：能进行绝对定量和相对定量, 可同时对无限个数据同 时进行分析，比对和作柱形图 2.6.3 分析应用：可以进行熔解曲线分析、突变分析、等位基因分析等 2.7 软件系统 2.7.1 定量PCR软件：有绝对定量和相对定量软件 *2.7.2 PrimerExpress软件 ：有，含正版引物与探针设计软件，可进 行Taqman MGB探针的设计及合成 2.7.3 荧光校正软件：有 *2.7.4 拷贝数分析软件：有，含CopyCaller分析软件 2.7.5 独立相对定量软件：有，可同时对无限个数据同时进行分析 *2.7.6 SNP分析软件：有，含AutoCaller分析软件
2.2 样品系统 2.2.1 样品通量: 单管、8联管、96孔板，并无需适配器 2.2.2 反应体积: 10-100ul 2.2.3 运行时间: <2小时 2.2.4 机械设计: 样品无需移动 2.2.5 反应后保存: 可降温至4℃保存
2.3 荧光系统 2.3.1 荧光染料：FAMTM/SYBR Green I, VIC /JOETM, NEDTM/TAMRATM/Cy3, ROXTM/Texas Red, Cy5 2.3.2 荧光校正：软件支持Rox荧光校正去除误差 2.4 光学系统 2.4.1 激发光源：卤钨灯，配备时间监测及自我诊断程序 2.4.2 滤光系统：五色光源滤光片结合荧光滤光片（630nm-650nm， 570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm） 2.4.3 检测系统：CCD摄像机一次成像 2.4.4检测方式：实时动态检测，动态显示，可同时检测5种荧光染料， 必须有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm这五块滤光片 *2.4.5 实验要求：必须能同时检测FAM、VIC、TAMRA、ROX四种 荧光，能进行探针法定量，开展CNV研究
3 基本配置和附件 3.1 商用主流计算机及UPS 3.2 安装试剂盒和纯荧光校正板 3.3 RNASE P校验板 3.4 SDS系统操作软件 3.5 Primer Express3.0引物和探针设计软件 4 选件：无 5 资格证明：有ISO9001质量认证，符合CE认证，有医疗器械注册证 6 技术服务 6.1 安装、调试：需要原生产厂家现场安装调试 6.2 培训：需要原生产厂家进行安装培训和售后培训 6.3 技术资料：全套安装、操作和维护使用说明书，软件免费更新 7 质量保修期 7.1 保修期：自验收合格日起整机（包括配件）一年全保，终身维护 7.2 保修点：国内至少三个保修点可提供部件更换，原厂专业维修 Fra bibliotek
2.8 试剂盒 2.8.1 安装试剂盒：有 2.8.2 基本试剂盒：原厂家可提供完备的基本试剂盒供选择 2.8.3 SNP试剂盒：可提供原厂家500万种SNP检测试剂盒 2.8.4 转基因检测试剂盒：原厂家可提供国际标准的转基因检测试剂盒 2.8.5 拷贝数试剂盒：可提供原厂家160万种SNP检测试剂盒并有配套 分析模块 2.8.6 药物代谢酶分型试剂盒：原厂家可提供药物代谢酶SNP分型试剂 盒 2.8.7 MicroRNA分析试剂盒：原厂家可提供包含有针对人、小鼠、大 鼠、拟南芥、果蝇和线虫的MicroRNA分析产品。 2.8.8 基因表达试剂盒：可提供原厂家100万种基因表达检测试剂盒 *2.9 试剂、耗材：开放式 2.10 装机指标：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷贝数的差 异
AC G TGCAC T GTA G G AT GG AT GT C AG CA AT C C C C TAC
衡量荧光定量PCR仪的参数（招标）
（以AB 7500为例）
1 工作条件：220V电压，10A电源。相对湿度<80%。热功率<2600W 2 技术规格 2.1 热循环系统 2.1.1 加热冷却方式: 半导体 2.1.2 升降温速率: 3.5℃/秒以上 *2.1.3 温度范围: 4℃-99.9℃ *2.1.4 控温精确度:±0.25℃