PCR基本原理及方法_图文.
PCR基本原理示意图PPT课件
精选课件
4
新链延伸方向 总是从5’ → 3’
5 ’
引物2 3’
升温至 Taq酶最 适温度
3’
引物1 3’
3’
5’
在Taq酶最适温度下，新链合成，不断延伸；在终止
延伸时，新链的长度可能长于目的片段，延伸至目的
片段外侧区域。
精选课件
5
新链延伸方向 总是从5’ → 3’
5 ’
引物2 3’ 5’
3’
升温至 Taq酶最 适温度
PCR基本原理示意图
精选课件
1
氢键
5’
3’
3’
5
’
待扩增目的 DNA片段（红
色区域）
5’
3’
3’
5’
加热 变性
5’
3’
3’
5’
加热变性后氢键被破坏，模板分成两条单链。
精选课件
3
引物是人工设计并合成 的脱氧核苷酸短链。
5 ’
引物2
退火 （迅速 降温）
3’
引物1
3’
5’
退火后，由于引物分子小，浓度又高，在模板之间 还未复性前就迅速与模板匹配结合。
反复经过变性、退火、延伸等步骤， 经过约30~40次循环，下面这种产物将 以指数级方式递增，成为主要产物。
5’
3’
3’
5’
精选课件
10
在PCR循环过程中，以下双链 形式的DNA只能以算术级方式扩增。成为
PCR反应的副产物。
难点？！！
5’ 5’
5’ 5’
精选课件
11
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3’
PCR的基本原理和应用 PPT课件
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR原理与操作
PCR原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction），也称为聚合酶链反应，是一种重要的分子生物学技术。
它是通过体外复制DNA分子来产生大量DNA分子的方法。
PCR技术在基因工程、医学诊断、犯罪现场调查等领域有广泛应用。
PCR技术依赖于DNA分子的核酸扩增过程。
其基本原理可分为三个步骤：变性、引物的结合和延伸。
1.变性：PCR反应开始时，DNA样本被加热至95℃到98℃的高温。
这个高温的作用是将DNA的两个螺旋链分离，使之成为单链DNA。
2.引物的结合：PCR反应中，引物是一段由合成的DNA片段。
引物的序列与待扩增的DNA序列的两端互补。
引物的加入使得单链DNA在较低的温度下重新连成双链结构。
引物被限制性核酸酶进行体外合成。
这个链合成过程是在一个低于变性温度的温度下进行的。
3.延伸：在第二步引物的结合后，加入了一定浓度的DNA聚合酶。
DNA聚合酶能够扩增引物，使得新的DNA链得以合成。
而且PCR反应中还加入了一定浓度的dNTPs（核苷酸三磷酸聚合物），它们是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液。
通过这些反应物，DNA聚合酶能够与引物进行大量的扩增。
PCR操作步骤及注意事项：1.样品准备：a.提取待扩增的DNA，保证DNA纯度和浓度。
b.使用无细菌污染的试剂和消毒的实验室设备。
2.PCR体系准备：a.准备PCR反应液，包括模板DNA、引物、酶、缓冲液、dNTP和盐。
b.根据所需扩增的目标序列和引物设计合适的引物。
c.确保PCR反应液没有污染，防止产生假阳性或假阴性结果。
3.PCR反应设置：a.取合适的PCR管，加入PCR反应液。
b.打开PCR仪，将PCR管放入合适的位置，设置温度和时间参数。
c.检查PCR仪的热盖是否正常工作，以确保反应条件的稳定性。
4.PCR反应：a.将PCR管放入预热PCR仪中，并启动程序。
b.进行PCR循环扩增反应，根据需要进行不同数目的循环。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
《PCR详细讲解》课件
Oligo
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
Primer BLAST
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
《PCR详细讲解》
半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
PCR基本原理及注意事项教材教学课件
本课程将深入介绍PCR技术的基本原理、注意事项以及在各个领域中的广泛 应用。希望通过这份教材教学课件，向大家分享我的专业知识和对PCR技术 的热爱。
PCR的定义和概述
PCR (聚合酶链式反应) 是一种体外扩增特定DNA片段的方法。它通过反复复制目标DNA，从而在短时 间内产生大量DNA。PCR已经成为现代生物学和医学领域中不可或缺的技术。
PCR中的不同温度环境和条件， 如变性温度、退火温度和延伸 温度，对PCR反应起着重要的 作用。
什么是PCR引物
PCR引物是一段能够与目标DNA序列互补配对的短链寡核苷酸。引物的选择和设计对PCR的成功至关 重要。
设计PCR引物的注意事项
引物长度
通常选择15-30个碱基的引物长度，以保证特 异性和效率。
由于引物的设计，PCR 可以选择性地扩增目标 序列，消除其他干扰。
PCR反应只需数分钟至 数小时即可产生大量 DNA，快速得到可靠的 结果。
PCR反应涉及的原理和基础
DNA结构
PCR利用了DNA的双螺旋结构 和DNA聚合酶的酶活性，实现 DNA的复制和扩增。
引物设计
温度控制
合适的引物设计对PCR结果至 关重要，需要考虑引物长度、 碱基组合和引物之间的互补性。
PCR反应的三个步骤
1
变性
将DNA变性为两条单链，使其可以作为模板。
2
退火
引物结合到目标序列，并使DNA聚合酶开始复制。
3
延伸
在适当的温度下，DNA聚合酶会从引物的3'端开始合成新的DNA链。
重复性PCR的技术优势
1 高灵敏度
2 高特异性
3 高速度
PCR可以检测极低浓度 的DNA，使其在病原体 检测和基因分析中得到 广泛应用。
PCR原理及操作
PCR原理及操作PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域被广泛应用的技术，用于从DNA样本中扩增特定的DNA片段。
PCR的原理和操作是研究者进行分子生物学研究、基因检测和分析的关键。
PCR的原理：PCR的原理基于DNA的复制过程，它通过模拟DNA复制的三个步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定的DNA片段。
1. 变性（Denaturation）：在PCR反应开始时，将DNA加热至94-98°C的高温，使双链DNA分离成两条单链模板。
2. 退火（Annealing）：降低温度至50-65°C，引入特定引物（寡核苷酸），它们能够与目标DNA的特定序列互补碱基配对。
这些引物作为反向互补物，将与目标DNA的两个单链末端的互补序列碱基配对。
3. 延伸（Extension）：在72°C下，加入DNA聚合酶，它能够在引物的协助下将新的DNA链合成。
聚合酶沿着两条单链模板移动，在每个模板上合成新的DNA链。
该过程在一定的温度和时间下进行，使DNA聚合酶能够在引物上扩增DNA。
上述循环会重复数十次，通过指数式扩增目标DNA的数量。
最终，PCR反应产生了大量的目标DNA序列，可以用于进一步的分析和研究。
PCR的操作：PCR的操作依赖于精确的试剂配制、合适的温度控制和合理的反应设计。
以下是PCR的基本操作步骤：1.DNA提取：首先，从样本中提取DNA。
提取方法可以根据样本类型的不同而有所区别。
2.PCR体系的配制：根据需要扩增的目标DNA片段确定引物的序列和浓度，准备合适的引物。
然后将引物和其他反应物如核苷酸、聚合酶和缓冲液等加入反应体系中。
3.PCR反应设置：将反应体系分装到PCR管或特定的聚合酶链反应管中，并在热循环仪中设置适当的温度和时间参数。
4.PCR循环参数：一般来说，PCR反应由多个循环组成。
每个循环通常包括变性、退火和延伸阶段。
循环参数的设置可以根据需要和特定的PCR试剂进行调整。
PCR技术试验方法及原理
注意事项
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
五、PCR的循环参数
1. 预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
四、PCR反应条件的控制
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
（1）引物设计不合适
① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。
PCR原理及检测方法
第12页，共53页。
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
0.02 ～
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与 dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓 度高 0.2 ～ 2.5 mM。
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合， 基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单
链。 2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补 结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的 高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与 引物之间。
0.1ul 0.5ul 0.5ul
第35页，共53页。
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括
阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差 ，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么 N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么 N=n+2。
DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段
， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存
在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行
定量分析。
第27页，共53页。
• 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR
技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值 和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为
设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩 增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的 缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差 的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数被称为 CT 值
PCR的原理、操作步
PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留
标本的运送
• 标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽 可能快的送至检测实验室，如运送时间需2 小时以上，必须用冰盒送至实验室。
• 标本中如加入了适当的稳定剂，如用于 RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC） 的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA 抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。
2.标本的验收
丙型肝炎病毒（RNA血清）
• a）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和试管依次编号后， 弃去手套。
• b）双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心 管，对应标本编号，置于离心管架上。
• c）先用移液器混匀RNA提取液A，然后吸取10µl加入到编好号的离心 管中，再用移液器吸取50µl 血清加入，最后用移液器加入200 µlRNA 提取液B，在震荡器上震荡混匀，放置5分钟，然后6000转1分钟离心。
我科开展的PCR检验项目
• 乙 肝 病 毒（HBV－DNA） • 丙 肝 病 毒（HCV－RNA） • 结 核 杆 菌（TB－DNA） • 肺 炎 支 原 体（MP-DNA） • 梅毒螺旋体（TP－DNA） • 淋 球 菌（NG－DNA） • 沙 眼 衣 原 体（CT－DNA） • 解 脲 支 原 体（UU-DNA） • 幽门螺杆菌(HP—DNA)
PCR技术原理简介 PPT
基本原理
变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢
键断裂，双链解离成单链DNA 模板
模板
基本原理
退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结
构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于 模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而 模板DNA双链之间互补的机会较少
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR流程
PCR完成后，取1-2ul性琼脂糖凝胶电泳检测，理想结果是 目的基因扩增条带单一，片段长度与预期相符合，条带清 晰。
2、在临床医学上的应用
①病原体诊断：利用PCR可以检测标本中的各种病毒、 细菌、真菌、支原体、螺旋体、寄生虫等病原体；标 本可以是组织、细胞、血液、排泄物等。
反应体系
引物设计的原则：
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不 佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好 是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于有 效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计 Tm值。 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其 是3’端不应超过3个连续的G或C。 4. 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折 叠成发夹结构影响引物本身复性。
10-25mmol/L
Tris-HCl
KCl 50mmol/L
1.5mmol/L
MgCl2
明胶或牛血清白蛋白
100ug/ml
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～ 2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特 异扩增； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应
PCR基本原理示意图
目录
• pcr基本概念 • pcr基本原理 • pcr实验操作 • pcr技术优化 • pcr技术应用 • pcr技术展望
01 pcr基本概念
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02 pcr基本原理
pcr基本原理
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03 pcr实验操作
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04 pcr技术优化
pcr技术优化
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05 pcr技术应用
基因克隆与测序
基因克隆
PCR技术可用于克隆特定基因片段， 通过多次扩增目标基因，获得大量相 同的基因片段，为后续的基因分析和 功能研究提供基础。
基因测序
PCR可以结合测序技术，对特定基因 进行序列分析，有助于深入了解基因 的结构和功能，为遗传疾病的诊断和 治疗提供依据。
未来PCR技术将向微纳尺度发展，实现更小体积的检测，满足单细 胞甚至单分子水平的分析需求。
多组分同时检测
通过多色荧光标记和光谱分离技术，实现多组分的同时检测，提高 检测通量和灵敏度。
pcr技术面临的挑战
1 2
灵敏度和特异性
提高PCR技术的灵敏度和特异性是当前面临的重 要挑战，有助于降低假阳性或假阴性的风险。
肿瘤诊断与治疗
PCR可以用于肿瘤相关基因的突变检测和基因表达分析，有助于肿瘤的诊断、分 型和预后评估。同时，PCR还ຫໍສະໝຸດ 以用于指导肿瘤个体化治疗和药物研发。
06 pcr技术展望
pcr技术发展趋势
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的发展，PCR技术将更加自动化和智 能化，提高检测速度和准确度。
微纳尺度发展
基因编辑与基因治疗
最新定量PCR基本原理及方法ppt课件
FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
Ampliflour Probe，LUX 定量分析
➢ 基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman 根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon
三．荧光定量PCR不同方法学的应用
➢ 研究目的 ➢ 标记方法
➢ 研究目的
定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc
熔解曲线分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET
Cam/Ccr=
×100%
血清淀粉酶×尿肌酐
四 血清脂肪酶测定
发病24－72小时开始升高，持续 7－10天。
正常值＜0.6u，当＞1.5U（Cherry－Crandall）
五 血清正铁血白蛋白
六 生化检查
四高
四低
血糖（20-60%)
K （10-20%）
转氨酶
白蛋白
胆红素
Ca（25%）＜ 1.75mmoL/L
定量PCR基本原理及方法
内容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
➢ 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，
经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ↔ 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
PCR技术与方法 PPT课件
引物设计原则
3.GC的合理含量： •G+C含量一般为40%-60%
•Tm = 4（G+C）+2（A+T）
•引物Tm值与退火温度有关，Tm 最好在55~80º C之间，以接近72º C为
好。
（二）重组PCR（recombitant PCR, RPCR)
为了研究基因功能，有时需要将两个不 同的基因融合在一起产生重组体。 PCR 技术用于构建重组体的方法称重组PCR。
35
重组PCR
引物x的5`部分与引物y的5`部分互补
了研究基因功能，有时生重组体。 PCR技 y 术用于构建重组体的方法称重组PCR。
引物浓度
• 两条引物一般各在0.1~0.5μmol/L, 浓度太 高会引起错配及非特异性产物扩增，增 加形成引物二聚体的几率；太低则可能 达不到扩增效果或产量太低。
引物合成的质量
• 引物一般经PAGE或HPLC纯化，以减少 非特异扩增和信号强度. • 冻干引物可以常温下运输，-20º C可以保 存12~24个月，甚至更长，液体状态于 -20º C可以保存6个月或更长
gagattttgg aagtggcttt gaagaaagca gcaagtcaca caaggaggat
acatctctac tacctgggct ccctcagcca cctcctgtca cttccccacc cctggctgga ggcagcacca cagaagatcc tagaacagaa 3` 3`ccgtcgtggt gtcttctagg5` GC%=60
x
5` 3` 3` 5`
PCR原理及其操作PPT课件
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34
① 变性温度与时间：
• 一般93℃～94℃，1min足以使模板 变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的
活性有影响。
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35
② 退火(复性)温度与时间：
• 退火温度是影响PCR特异性的重要 因素
• 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列 的长度
• 复性时间一般为30～60s，足以使引 物与模板之间完全结合
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37
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
使
①双链DNA变成单链，
②单链DNA与人工合成的引物退火，
③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延
伸为双链D精N选PAPT课。件
3
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
此循环反复进行，可使目的DNA得 以迅速扩增。
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22
理 论 扩 增 率 ： 2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
PCR扩增原理及过程ppt
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
(3)碱基的随机分布：
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤 或聚嘧啶的存在。 3’末端最佳选择为G 和C；但不应超过3 个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引 发。但现在的观点认为，在3’端尽可能选用T，少用G或C ，这样可更好的避免假引发。（错配率： T < G或C < A ）
一、PCR的基本原理 1、基本要素和扩增原理 DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR的
基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过程 中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩 增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制中 不可缺少的。
与单纯的DNA复制不同的是，PCR扩增总是在两个引 物的存在下对DNA的两条链同时进行复制，复制 的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制 ，使这样的DNA复制重复进行，从而得到大量的 位于两个引物之间的DNA片段，即目的片段。前 一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模板 ，扩增产物以几何级别递增。
3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板 是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一 般要有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应 避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影 响扩增的效果，一般要求含量合适，3ⅹ105分子数（1μg ）（提高产量，减少非特异性扩增）；
2、PCR扩增的步骤
首先将模板DNA置于92~96度进行变性处理，使双 链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度称 为解链温度Tm，且热变性不改变其化学性质；染 后退火，将温度降至37~72度，使引物与模板的互 补区结合，最后在72度条件下，DNA聚合酶将 dNTP连续加到引物的3’羟基端合成DNA这个步骤 称为延伸。这三个热反应过程的重复性称为一个 循环经过20~40个循环可扩增得到大量位于两条引 物序列之间的DNA片段。
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Medical Molecular Biology Principle and Applications of PCR （Polymerase Chain Reaction） Department of Biochemistry and Molecular Biology 1Contents History of PCR Concept and principle of PCR PCR reaction system Types and Applications of PCR 2ReplicationSubstances Involved in DNA replication and Functions substrate (底物: 4 dNTP。
合成新链的原料。
template (模板: 解开成单链的DNA母链。
指引dNTP按碱基互补配对原则合成新链。
primer (引物: 一段寡核苷酸序列。
提供3′-OH末端使dNTP 可以依次聚合。
polymerase (聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶( DNA-pol Other enzymes & protein factors： Helicase, Topoisomerase：解链解旋，防止打结。
SSB （单链DNA结合蛋白）：稳定已解开的单链。
Primase：催化RNA引物生成。
DNA ligase：连接两段相邻的岡崎片段。
4一、History of PCR 1、Khorana(1971等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。
2、1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。
3、1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR 技术。
4、1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
56Pacific Coast Highway1. History of polymerase chain reaction Kary MullisHe was awarded the Nobel Prize in 1993forhis talented invention.2. Background knowledge of PCRo DNA replicationo DNA denaturationo Hybridization7•DNA Replication: Template3’89DNATarget fragment Primer 1 Primer 25′3′5′3′3′5′3′5′In vivoHelicase, DNA topo-isomerase10heating•DNA Denaturation Denaturation11Primer 1 Primer 25′3′3′5′•Hybridization hnRNA/DNA mRNA12二、Principles of PCR5′5′Target fragment 5′Primer 15′Primer 25′1st cycle5′The 2nd cycle5′5′Target fragment 5′Primer 15′Primer 25′5′1st cycle5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′5′The 3th cycle1st cycle 2nd cycle3rd cycle4thcycle exponential amplification 20-40 cycles 30 sec40 sec45 sec* What is PCR?o PCR is an in vitro method of DNA synthesis by which a specific target fragment of DNA can be rapidly amplified.是一种特异DNA片段的体外快速大量扩增技术。
1710 min at 72 ℃for final product extension or brief storage 1h at 4 ℃PCR procedure5 min at 95 ℃for complete DNA denaturation Determined by primer* Principle of PCR无细胞分子克隆法:在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种dNTP,耐热DNA聚合酶, 一对合成的DNA引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品经过30次循环,最终使特异区段的DNA 扩增了数百万倍。
1920The Characteristics of PCR o High specificityo High sensitivityo Simple and rapid operation o Wide applicabilityHigh specificity22specificity of PCR is determined by the specificity of primerPrimer2引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR 反应结果的关键。
引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。
* Principles of Primer Designo Primers are best designed in the coding region of cDNA templates o Length:15-30bpo Random distribution of bases,(G+C%=45%~55%, Tm~72℃.Tm= 4(G+C+2(A+To Complementary sequences should not exist in Primer itselfo Complementarity should not exist between the primerso Homologous of Primers and non-amplified region<70%,the continuous eight bases in 3 'end of primer can not be completely complementary to the non-amplified regiono 3 'end of Primer must be complementary to the template, avoid the third base of codon,the best choice for T, G, Co 5 'end of Primer can be free out of the template and modified231. Search and analyze the amplified sequencePCR是在体外特异性扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的一种方法。
已知序列的来源:1Genbank (/Genbank/index.html2 EMBL bank-欧洲分子生物学实验室(EMBL的数据库(/embl/3 日本的DNA数据库DDBJ(DNA Data Bank of Japan(http://www.ddbj.nig.ac.jp/.24252627282930cDNA -mRNA Concepts5‘3’5‘3‘mRNA cDNA cDNA5‘5‘33cDNA312. Length of primer15-30 bases因目的而选择适应的长度:检测一般较短,20个核苷酸左右构建时若加酶切位点,则相对要长,25-30个核苷酸Usually: 18 -27basesToo shortToo long3. (G+C%in primersGC content:45 ~ 55%Tm:55 ~ 61℃Difference in Tm=< 2℃5'-ATCATGTAGTCAGCAGTGGACCAGGG-3'计算?互补序列的GC%3233(1 3'末端的碱基必须与末端DNA 的碱基正确配对。
TGATGATCGTGTACC-35'-GGCATGCAACT 3'-…………GCTAGAGATCACTACTAGCACATGGA …………-5'A T C G primertemplate DNA'(23‘末端的碱基最佳选择是T 、G 或C4.3’end of primer(33'末端连续8个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补34(1 引物的5' 末端序列与模板的序列不一定要互补。
引物5’端可游离十几个碱基,可进行修饰TGATGATCGTGTACC-3'5'-GGCATGCAACT 3'-............GCTAGAGATCACTACTAGCACATGGA (5A T C G primer template DNA5.5’end of primer35(2引物中5’端可引入酶切位点G A C 5'-GGCATG GGATC TGATGATCGTGTACC …………3T '5'3'保护性碱基酶切位点的5’端上游不能少于3个核苷酸,否则这个位点是切不开的。
有些酶,如Hin d Ⅲ, 至少需要7个核苷酸。
(分析基因的酶切位点、多克隆位点的选择3’5’5限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记引入起始或终止密码子等6. 引物自身或引物之间不能互补(1引物内部不应形成二级结构,链内或链间(互补序列不能超过3个碱基。
(2一对引物之间,尤其是3’末端不能有互补序列存在。
377.错配388.同源性分析1引物与基因的其他位置是否互补引物与非扩增区同源性<70%2两引物与其他基因的同源比对:blast39* 引物设计原则o引物最好在模板cDNA的编码区内设计o引物长度:15-30bpo引物中碱基分布:尽可能随机分布,G+C占45%~55%,Tm值最好接近72℃。
Tm= 4(G+C+2(A+To引物自身不应存在互补序列o引物之间不能互补o引物与非扩增区同源性<70%,3’末端连续8个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补o引物3’端碱基一定要与模板互补,避开密码子的第三位,最好选择G/C/T o引物5’端可游离十几个碱基,可进行修饰40What should I do?Primer premier5(自动搜索Oligo6 (by Wojciech Rychlik:commercially available (NationalSciences, Inc(引物评价DNAmanDNAstar41Primer Premier 5.0 使用简介主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif查找4、同源性分析4243sense primer & antisense primer下游引物antisense primer上游引物sense primer5′3′3′5′编码链模板链与mRNA 或cDNA 中的序列相同与mRNA 或cDNA 中的序列互补4445464748。