化学蛋白质组学共51页
合集下载
蛋白质组学介绍-PPT精选文档67页
• PTMs involving addition include:
• Acetylation - the addition of an acetyl group, usually at the N-terminus of the protein
• Alkylation - the addition of an alkyl group (e.g. methyl, ethyl)
• Or - A complete description of proteins expressed in any given cell at any given time
Proteomics
• A cellular proteome is the collection of proteins found in a particular cell type under a particular set of environmental conditions such as exposure to hormone stimulation
• This is due to:
• alternative splicing of genes
• post-translational modifications like glycosylation or Phosphorylation.
alternative splicing of genes
• PTMs involving addition include:
• Phosphopantetheinylation - the addition of a 4'phosphopantetheinyl moiety from coenzyme A, as in fatty acid, polyketide, non-ribosomal peptide and leucine biosynthesis
• Acetylation - the addition of an acetyl group, usually at the N-terminus of the protein
• Alkylation - the addition of an alkyl group (e.g. methyl, ethyl)
• Or - A complete description of proteins expressed in any given cell at any given time
Proteomics
• A cellular proteome is the collection of proteins found in a particular cell type under a particular set of environmental conditions such as exposure to hormone stimulation
• This is due to:
• alternative splicing of genes
• post-translational modifications like glycosylation or Phosphorylation.
alternative splicing of genes
• PTMs involving addition include:
• Phosphopantetheinylation - the addition of a 4'phosphopantetheinyl moiety from coenzyme A, as in fatty acid, polyketide, non-ribosomal peptide and leucine biosynthesis
蛋白质组学及技术介绍最全PPT
生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原 理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异 来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白 酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质 谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电 离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI- MS）。
C中y间2,部Cy分3是,C平y5衡部分二b维ala凝nc胶e g电rou泳p 法：
• reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117Da，因此iTRAQ试剂共四种；
2在、二多维维电电泳泳的技基术础，上包进括行二荧二维光维凝标胶记凝电胶泳法电、泳自由的流原动电理泳是法、第毛一细管向区基带电于泳蛋法等白；质的等电点不同 二级质谱： 肽质量用指纹等图电谱（聚PM焦F）分。离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分 iT1R.AQ试剂是一种小离分，子同把重复元素杂化蛋学物白质混，包合括物三部中分的： 蛋白质在二维平面上分开。 定义：同位素标记相对和绝2-对D定E量有(is较oba好ric的tag分s f辨or r率ela，tiveSaDndSa-PbsAolGuteEq或ua单ntit相atiIoEn，Fi的TRA最Q)好技术分由AB SCIEX公司研发的一种 体例外如同 ：种Le同i等位通素过标2-记辨DE的和率相基对仅质与辅为绝助对1激0定光0量解个技析术蛋电。离白飞，行时而间2质-D谱等E蛋大白约质组为学3相0关0技0个术对蛋膀白胱癌。患者的尿蛋白进行分离鉴定，获得14个差
蛋白质组学及技术介绍
概念
蛋白质组是在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰 的全部蛋白质。
C中y间2,部Cy分3是,C平y5衡部分二b维ala凝nc胶e g电rou泳p 法：
• reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117Da，因此iTRAQ试剂共四种；
2在、二多维维电电泳泳的技基术础，上包进括行二荧二维光维凝标胶记凝电胶泳法电、泳自由的流原动电理泳是法、第毛一细管向区基带电于泳蛋法等白；质的等电点不同 二级质谱： 肽质量用指纹等图电谱（聚PM焦F）分。离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分 iT1R.AQ试剂是一种小离分，子同把重复元素杂化蛋学物白质混，包合括物三部中分的： 蛋白质在二维平面上分开。 定义：同位素标记相对和绝2-对D定E量有(is较oba好ric的tag分s f辨or r率ela，tiveSaDndSa-PbsAolGuteEq或ua单ntit相atiIoEn，Fi的TRA最Q)好技术分由AB SCIEX公司研发的一种 体例外如同 ：种Le同i等位通素过标2-记辨DE的和率相基对仅质与辅为绝助对1激0定光0量解个技析术蛋电。离白飞，行时而间2质-D谱等E蛋大白约质组为学3相0关0技0个术对蛋膀白胱癌。患者的尿蛋白进行分离鉴定，获得14个差
蛋白质组学及技术介绍
概念
蛋白质组是在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰 的全部蛋白质。
蛋白质组学介绍
– Where does the diversity come from?
Answer: It’s the proteins!!!!!!!!!!!!
Proteomics
• The proteome is larger than the genome, especially in eukaryotes, in the sense that there are more proteins than genes.
• When the pre-mRNA has been transcribed from the DNA, it includes several introns and exons.
• The regulation and selection of splice sites is done by Serine/Arginine-residue proteins
• Methylation -the addition of a methyl group, usually at lysine or arginine residues. (This is a type of alkylation.)
• Biotinylation - acylation of conserved lysine residues with a biotin appendage
• However, the understanding of probably half a million human proteins encoded by less than 30,000 genes is still a long way away and the hard work to unravel the complexity of biological systems is yet to come.
Answer: It’s the proteins!!!!!!!!!!!!
Proteomics
• The proteome is larger than the genome, especially in eukaryotes, in the sense that there are more proteins than genes.
• When the pre-mRNA has been transcribed from the DNA, it includes several introns and exons.
• The regulation and selection of splice sites is done by Serine/Arginine-residue proteins
• Methylation -the addition of a methyl group, usually at lysine or arginine residues. (This is a type of alkylation.)
• Biotinylation - acylation of conserved lysine residues with a biotin appendage
• However, the understanding of probably half a million human proteins encoded by less than 30,000 genes is still a long way away and the hard work to unravel the complexity of biological systems is yet to come.
蛋白质组学-PPT课件
iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
辉骏生物：fitgene/
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
2：蛋白质组学研究内容
2.1：蛋白质的表达模式 （1）生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库。 （2）蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定。 2.2：蛋白质的功能模式 （1）蛋白质结构分析。 （2）蛋白之间相互作用，翻译后修饰，细胞定位等。
3: 化学标记法—iTRAQ
简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
辉骏生物：fitgene/
蛋白质组学及其应用PPT课件
3、Zheng M, Hu K, Liu W, Li H, Chen J, Yu X. Proteomic analysis of different period excretory secretory products from Clonorchis sinensis adult worms: molecular characterization, immunolocalization, and serological reactivity of two excretory secretory antigens-methionine aminopeptidase 2 and acid phosphatase. Parasitol ResMar;112(3):1287-97. 2013
7、Jun Pang, Weipeng Liu, Xiaopeng Liu, Liaoyuan Li, Youqiang Fang, Qipeng Sun, Shaojun Liu, Mingtao Li, Zulan Su, Xin Gao. Profiling protein markers associated with lymph node metastasis in prostate cancer by DIGE-based proteomics analysis. J Proteome Res. 2010;9:216226. 8、Yan-Xin Luo, Ji Cui, Lei Wang,,Dian-Ke Chen. Identification of cancer-associated proteins byproteomics and downregulation of b-tropomyosinexpression in colorectal adenoma and cancer. Proteomics Clin. Appl. 2009 9、Jing Luo, Jine Yang, Bing-Yun Yu, Wei Liu, Mingtao Li, Shi-Mei Zhuang. Identification of Siah-interacting protein as a potential regulator of apoptosis and curcumin resistance. Oncogene. 2010; 29(48):6357-6366 10、Liu W, Zhou XW, Liu S, Hu K, Wang C, He Q, Li M. Calpain-truncated CRMP-3 and -4 contribute to potassium deprivation-induced apoptosis of cerebellar granule neurons. Proteomics. 2009 Jul;9(14):3712-28. 11、Wang J, Wu S, Jin X, Li M, Chen S, Teeling JL, Perry VH, Gu J. Retinoic acid-inducible gene-I mediates late phase induction of TNF-alpha by lipopolysaccharide. J Immunol. 2008 Jun 15;180(12):8011-9. 12、Kang L, Yang ZL, Liu W, Zhang LJ, Liu SJ, Huang MJ, Li MT, Wang JP. (2008) Serum proteomic variation study in patients with Crohn disease. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2008 May;11(3):266-9. 13、Fu H, Dou J, Li W, Luo J, Li KC, Lam CS, Lee NT, Li M, Han Y. Mecamylamine prevents neuronal apoptosis induced by glutamate and low potassium via differential anticholinergicindependent mechanisms. Neuropharmacology. 2008 Mar;54(4):755-65.
7、Jun Pang, Weipeng Liu, Xiaopeng Liu, Liaoyuan Li, Youqiang Fang, Qipeng Sun, Shaojun Liu, Mingtao Li, Zulan Su, Xin Gao. Profiling protein markers associated with lymph node metastasis in prostate cancer by DIGE-based proteomics analysis. J Proteome Res. 2010;9:216226. 8、Yan-Xin Luo, Ji Cui, Lei Wang,,Dian-Ke Chen. Identification of cancer-associated proteins byproteomics and downregulation of b-tropomyosinexpression in colorectal adenoma and cancer. Proteomics Clin. Appl. 2009 9、Jing Luo, Jine Yang, Bing-Yun Yu, Wei Liu, Mingtao Li, Shi-Mei Zhuang. Identification of Siah-interacting protein as a potential regulator of apoptosis and curcumin resistance. Oncogene. 2010; 29(48):6357-6366 10、Liu W, Zhou XW, Liu S, Hu K, Wang C, He Q, Li M. Calpain-truncated CRMP-3 and -4 contribute to potassium deprivation-induced apoptosis of cerebellar granule neurons. Proteomics. 2009 Jul;9(14):3712-28. 11、Wang J, Wu S, Jin X, Li M, Chen S, Teeling JL, Perry VH, Gu J. Retinoic acid-inducible gene-I mediates late phase induction of TNF-alpha by lipopolysaccharide. J Immunol. 2008 Jun 15;180(12):8011-9. 12、Kang L, Yang ZL, Liu W, Zhang LJ, Liu SJ, Huang MJ, Li MT, Wang JP. (2008) Serum proteomic variation study in patients with Crohn disease. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2008 May;11(3):266-9. 13、Fu H, Dou J, Li W, Luo J, Li KC, Lam CS, Lee NT, Li M, Han Y. Mecamylamine prevents neuronal apoptosis induced by glutamate and low potassium via differential anticholinergicindependent mechanisms. Neuropharmacology. 2008 Mar;54(4):755-65.
蛋白质组学ppt
电转印到膜上
图像分析
Western blot检测
选择目标蛋白斑点，胶内酶切
质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）
获得肽质量指纹谱或肽序列标签
数据库检索鉴定蛋白质
Western blot、 免疫组化验证 蛋白质并确定 其定位
根据氨基酸序 列合成寡核苷 酸探针，克隆 基因
蛋白质功能研究，包 括蛋白质生物活性、 抗体制备、蛋白质相 互作用等方面
7
3.2.3 蛋白质组研究技术
一、双向凝胶电泳技术 二、液相色谱技术 三、生物质谱技术与蛋白质鉴定 四、蛋白质相互作用的研究技术
8
一、双向凝胶电泳技术 （一）2-DE的概念 two dimensional gel electrophoresis
• 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDSPAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝 胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质 等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是 根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。
22
（三）双向凝胶电泳图谱的计算机分析 • 细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成
百上千个蛋白质斑点的凝胶电泳图谱。凝胶图谱 分析包括确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深 浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑 点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、 数据库分析等内容。借助先进的计算机技术和生 物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提 取到有价值的信息。
记等
19
（一）考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色 方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲 烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋 白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围 可达1～55μg，灵敏度为30～100ng蛋白质 。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复 性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定 ，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于 银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋 白质的检测要求，样品用量大。
蛋白质组学及技术介绍通用课件
详细描述
蛋白质组学技术可以对蛋白质相互作用进行系统研究，发现新的药物靶点，并对药物作用过程中蛋白 质的应答变化进行监测，从而对新药进行有效的筛选和评价。同时，蛋白质组学还可以用于研究药物 的作用机制，解析药物在体内的生物过程，为新药的研发提供重要的理论支持。
生物进化研究
总结词
蛋白质组学在生物进化研究中的应用主要表 现在对不同物种间蛋白质结构和功能的比较 分析，揭示生物进化的规律和机制。
动物实验伦理
减少动物使用
尽量采用其他替代方法，减少动物的使用数量和痛苦。
优化实验方案
在必须使用动物的情况下，应优化实验方案，尽量减少动物的痛苦 和死亡。
严格遵循法律法规
遵守国家和地区的动物保护法律法规，确保实验的合法性。
数据共享与知识产权保护
数据共享
鼓励在学术领域内共享数据，促进科研合作和知识进步。
详细描述
蛋白质组学通过对不同物种间相似蛋白质的 同源性进行分析，可以发现物种间的亲缘关 系和进化历程。同时，蛋白质组学还可以通 过对蛋白质结构和功能的比较分析，发现物 种间在适应环境变化过程中产生的蛋白质变 异和进化机制。这些研究对于深入理解生物
进化的过程和机制具有重要意义。
04
蛋白质组学研究展望
通过测定蛋白质的氨基酸序列，确定蛋白质的组成和 结构。
质谱分析
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，推断蛋白质 的分子量和肽链组成。
数据库搜对，确定蛋白质的身份。
蛋白质定量技术
同位素标记技术
01
通过同位素标记目标蛋白质，利用其与未标记蛋白质在质谱中
鉴定蛋白质之间的相互作用关系，了解蛋白 质的功能网络。
蛋白质修饰分析
研究蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基 化、乙酰化等，以揭示其调控机制。
蛋白质组学技术可以对蛋白质相互作用进行系统研究，发现新的药物靶点，并对药物作用过程中蛋白 质的应答变化进行监测，从而对新药进行有效的筛选和评价。同时，蛋白质组学还可以用于研究药物 的作用机制，解析药物在体内的生物过程，为新药的研发提供重要的理论支持。
生物进化研究
总结词
蛋白质组学在生物进化研究中的应用主要表 现在对不同物种间蛋白质结构和功能的比较 分析，揭示生物进化的规律和机制。
动物实验伦理
减少动物使用
尽量采用其他替代方法，减少动物的使用数量和痛苦。
优化实验方案
在必须使用动物的情况下，应优化实验方案，尽量减少动物的痛苦 和死亡。
严格遵循法律法规
遵守国家和地区的动物保护法律法规，确保实验的合法性。
数据共享与知识产权保护
数据共享
鼓励在学术领域内共享数据，促进科研合作和知识进步。
详细描述
蛋白质组学通过对不同物种间相似蛋白质的 同源性进行分析，可以发现物种间的亲缘关 系和进化历程。同时，蛋白质组学还可以通 过对蛋白质结构和功能的比较分析，发现物 种间在适应环境变化过程中产生的蛋白质变 异和进化机制。这些研究对于深入理解生物
进化的过程和机制具有重要意义。
04
蛋白质组学研究展望
通过测定蛋白质的氨基酸序列，确定蛋白质的组成和 结构。
质谱分析
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，推断蛋白质 的分子量和肽链组成。
数据库搜对，确定蛋白质的身份。
蛋白质定量技术
同位素标记技术
01
通过同位素标记目标蛋白质，利用其与未标记蛋白质在质谱中
鉴定蛋白质之间的相互作用关系，了解蛋白 质的功能网络。
蛋白质修饰分析
研究蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基 化、乙酰化等，以揭示其调控机制。
蛋白质组学PPT课件
功能蛋白质组学 结构蛋白质组学
.
11
人类蛋白质组学研究进展
2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO）， 2003.12.15启动两个首批行动计划 1.人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学
院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。 中国第一次领导重大国际协作计划。 2. 人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头， 13国47个实验室参加。
双向电泳后的凝胶
经染色后蛋白呈现二维
分布图： 水平方向反映出蛋
白在pI上的差异， 垂直方向反映出它
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
们在分子量上的差别。
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
.
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
18
(1)等电聚焦 凝胶电泳 （ IFE）
利用载体两 性电解质在电场 作用下沿电场方 向在凝胶内形成 一个连续而稳定 的pH梯度。
根据一定的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混 合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共 价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方 式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳 定的IEF分离达到真正的平衡状态。
.
5
第一节 蛋白质组及蛋白质组学基本概念
.
6
什么是蛋白质组？
蛋白质组(proteome)：
PROTEOME = PROTE in +genOME Proteins expressed by a genome.
是指“特定细胞、组织乃至机体作为一个 生命单元中所有蛋白质的集合，即生命体中携 带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学ppt课件
Typical Mass Spectrum
Relative Abundance
aspirin
120 m/z-for singly charged ion this is the mass
Resolution in MS
Resolution in MS
783.455
QTOF
784.465 785.475
2 Unknown masses 1 hit on P21234 3 hits on P12345
Conclude the query protein is P12345
Database search
PeptIdent (ExPasy) Mascot (Matrix Science) MS-Fit (Prospector; UCSF) ProFound (Proteometrics) MOWSE (HGMP)
3: 化学标志法—iTRAQ
iTRAQ法。 1：样本经过不同处置后， 提取蛋白质; 2：蛋白质经过复原，封锁 后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同 的iTRAQ标志; 4：等量混合各种iTRAQ试剂 标志的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。
4: SILAC
SILAC法。 细胞培育条件下稳定同位素 标志技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)
450 698
2098 1940 (trp)
500
1000
1500
2000
2500
Query vs. Database
Query Masses Database Mass List Results
蛋白质组学PPT课件
蛋白质组定义
1，基因组表达的全部蛋白质。 2，在一种细胞/组织内存在的全部蛋白 质。
Proteome
• 1994 M.Wilkins and K.W.Williams
•
Macquarie University in Sydney
• Total Proteins Complement of a Genome
环境
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
REAL COMPLEXITY…
IS IN CELLULAR ROTEOMES • BEYOND THE GENOME… • Tissue Specific Expression • Alternate Splicing, (1/3 of all genes) • Post-Translational Modifications
Functional
Proteomics
• During human development, cell express different proteins
• Normal and cancer cells express different proteins
• Cell treated with and without drug express different proteins
– Types and Level:
– Signal Sequence cleavage – Glycosylation
– Phosphorylation – Farnylation – Isoprenylation – Acetylation
• All combine > 100-1000 fold increase in complexity
蛋白质组学总结ppt课件
如有可能，可加入强变性剂：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
13
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
11
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
12
三、用蛋白酶抑制Байду номын сангаас防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
3
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
10
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
13
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
11
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
12
三、用蛋白酶抑制Байду номын сангаас防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
3
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
10
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
相关主题