酶学基础

3.若酶活性太高，底物全变清，则将血清用 Tris-HCL缓冲液做稀释再重做。 4.标准曲线绘制：
加入物 橄榄油（ml） Tris-HCL缓冲 液（ml） 1管 1.0 3.0 2管 2.0 2.0 3管 3.0 1.0 4管 4.0 0.0
浓度(umol)
0.17
0.34 0.51
0.68
计算：A1-A2之值查标准曲线，得水 解底物的umol数。 脂肪酶活性（U/L）=酶水解底物的量 （umol）×100÷0.05×稀释倍数 参考区间：≤7.9U
试剂： 1.纯化橄榄油：层析纯氧化铝（70-325筛孔） 10g，置于2cm×15cm层析拄中，使呈疏松 状及平整状态，缓缓加入AR级橄榄油18ml， 用橡皮球加压，层析除去游离脂肪酸，得到 无色透明的橄榄油约10ml,而氧化铝转成黄 色。 2.橄榄油乙醇液：2g橄榄油加入200ml乙醇。 3.Tris-HCL缓冲液（pH8.8）:称取Tris3g， 去氧胆酸钠6g，溶于蒸馏水中，稀释到1L， 用浓盐酸调至pH8.8。
酶分为结合酶和单纯酶，单纯酶由约 100~1000个氨基酸组成，结合酶由酶蛋 白（apoenzyme）,辅因子（cofactor）。 按结合的紧密程度分为辅酶（coenzyme 为结合疏松的辅酶）和辅基（prosthetic group,与酶结合紧密）。 酶的结构分一、二、三级，有些 还有四级结构。酶的催化能力与辅酶和 其本身的结构有关。
【试剂】 试剂成分和在反应液中的参考浓度： 咪唑 100mmol/L PH(37。) 6.5±0.05 肌酸激酶 30mmol/L ADP 2mmol/L EDTA 2mmol/L 醋酸镁 10mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸 20mmol/L
AMP 5mmol/L AP5A 0.01mmol/L D-葡萄糖 20mmol/L NADP 2mmol/L 己糖激酶（37。） 4000U/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（37。） 2800U/L 血清体积分数 0.0435(1:23)
已经证明，在测定CK开始时，当向反应混 合液加入底物（CrP）后，反应速率呈现一 个缓慢上升的延滞时相。在优化测定系统 中，典型的延滞时间为：25。C110s,39。 C90s,和37。C60s。这种现象具有重要的 实用意义，因为测定时间的不适当将引起 反应速率测定的不准确或测定值偏低。

生物发光方法比分光光度法更加灵敏，已 用于CK活性测定。在这些方法中，逆向反 应与荧光素或荧光素酶反应连接，反应如 下： 肌酸激酶+ADP→肌酸+ATP ATP+荧光素→AMP+氧化型荧光素+ppi+ 荧光 反应中所产生荧光的强度是测定酶活性的 依据。
原理：血清或血浆中α-淀粉酶催化分子中 α-1.4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖 及含有α-1.6糖苷间支链的糊精。在底物 充足的情况下，反应后加入碘液与未被 水解的淀粉结合，生成蓝色的复合物。 其兰色的深浅与空白管比较，可计算出 淀粉酶的活力单位。
试剂： 1.0.4g/L缓冲淀粉液：9g氯化钠+22.6g无水磷酸 氢二钠+12.5g无水磷酸二氢钾，溶于500ml蒸馏 水中，加热煮沸。取0.4g可溶淀粉溶于10ml蒸馏 水，加入上述沸腾液体中，水洗小烧杯，一并倒 于沸腾液体。再加入5ml37%甲醛，蒸馏水调节 至1L。 2.0.1mol/L碘储存液：1.7835g碘酸钾+22.5g碘 化钾溶于400ml蒸馏水中，缓慢加入4.5ml浓盐酸， 边加边搅拌。蒸馏水稀释至500ml，充分摇匀。 棕色瓶储存2~4℃冰箱。 3.0.01mol/L碘应用液：取碘储存液，蒸馏水稀释 10倍。
【原理】 CK催化CrP 转变成Cr,同时ADP磷酸化成 ATP, 然后进行酶偶联反应。反应式如下： 肌酸激酶+ADP →肌酸+ATP ATP+葡萄糖 →葡萄糖-6-磷酸+ADP 葡萄糖-6-磷酸+NADP++→6-磷酸葡萄糖 +NADPH+H+ 上述反应式中，第一步CK反应产生ATP，用 HK/G6PD(己糖激酶/葡萄糖--磷酸脱氢酶)偶 联反应，最终使NADPH，可在340nm波长进 行监测。
【计算】 CK(U/L)=△A/min ×106/6220×2.3/0.1=△A/min×3698 式中，2.30为反应液的总体积;0.10为血清用量， 血清占反应液的体积分数为0.04348；6220为 NADPH在340nm波长的摩尔吸光度；△A/min为 平均每分钟吸光度变化值。 【参考区间】 性别不同，参考区间有差别。37。C，健康成年 男性：38～174U/L;健康成年女性：26～140U/L。
2.本法线性至少可达3000U/L，高于此值的 标本应用150mmol/L氯化钠溶液稀释后再 测，但是，由于血清中的抑制物质也被稀 释，稀释后标本的测定结果较高，如1：2 稀释血清的测定结果比原血清的测定结果 约高10%。所以，最好用已知CK值得正常 血清作稀释剂。
3.试剂空白速率(△A/min)应小于0.001，即 小于3.7U/L。所谓试剂空白速率，即用蒸 馏水代替血清，按照CK测定操作步骤进行 测定所得的测定值。 4.EDTA可防止NAC由于二价离子催化发生 的氧化，有利于试剂的稳定。 5.血清Ca2+ 是Mg 2+ 的竞争性抑制剂， 加入2mmol/L的EDTA可消除Ca2+ 的影响； 当Mg 2+ 为10mmol/L时，虽与EDTA结合， 但不影响对CK的激活。
2.3mmol/LNADP,4000U/L HK,2300U/L G6PD,pH6.5,37。C)取128mmol/L咪唑醋酸盐缓 冲液90ml，加98mgADP，211mgAMP， 1.1mgAP5A,414mgD-葡萄糖，181mgNADP(二 钠盐)及375mgN-乙酰半胱氨酸（ NAC）溶于适 量蒸馏水中，用1mmol/L醋酸调节至pH6.7(25。 C)或pH6.59（37。C),再加260～290U的HK及 175U的G6PD，以蒸馏水稀释到100ml。2溶液在 340nm波长，比色杯光径1.0cm，吸光度应小于 0.350A。在6。C可稳定5天，室温仅稳定30h。
6.红细胞及几乎所有组织中含有腺苷酸激酶(AK), 催化如下反应。 2ADP→ATP+AMP 上式反应中所生成的ATP，可导致表现CK活性增 加。氟化物、AMP及AP5A抑制AK活性。氟离子 与镁离子形成不溶性的MgF2,故不宜用氟化物作 为抑制剂。AMP是AK的竞争性抑制剂。AP5A竞 争性抑制肌肉及红细胞的AK,对肝及肾的AK抑制 很小。5mmol/L AMP与10umol/L AP5A合用，能 有效地抑制红细胞和肝细胞的AK。
【操作】 主要分析参数： 温度 37。C 波长 340nm 比色杯光径 1.0cm 孵育时间 180s 延滞时间 120s 监测时间 120s 吸光度读数点 ≥6 取适量的应用试剂I和应用试剂II置于37。C水浴 中，使温度达到37。C，按照下表所示操作。
CK测定操作步骤 2.00ml 应用试剂I(温度平衡至37。C) 0.10ml血清（充分混匀，孵育180s，反应 温度必须达到37。C） 0.20ml应用试剂II(反应启动试剂)，充分混 匀，等待120s(延滞时间)，检测吸光度变化 120s，吸光度读数点≥6
酶的作用是通过与底物结合形成一种 或几种中间复合物来减低反应的活化能 来实现的。酶的反应可用米-曼氏方程表 示： k1 k2 E + S
→
ES
→
E + P
k-1 酶 底物 酶底物复合物 酶 产物 酶促反应的因素主要有酶浓度、 底物浓度、PH、电解质、辅酶、激活剂、 抑制剂。
临床上主要测定的酶多存在于血清， 故习惯于称血清酶，包括ALT、AST、 GGT（r-GT） 、ALP、CHE、CK、LDH、 AMY、LPS等。 淀粉酶（amylase，AMS）测定
3、应用试剂II(345mmol/LCrP) 称取1.25gCrP(二 钠盐)，用蒸馏水溶解并稀释到10ml。此溶液在 340nm波长，比色杯光径1.0cm，吸光度应小于 0.150，在4。C可稳定3个月。 【仪器】 全自动生化分析仪或窄带宽分光光度计，具有 （37±0.2）。C恒温比色杯室，波长可调至339 或340nm，并可自动监测吸光度的变化和计算酶 活性单位等功能。
湖南省人民医院检验科——吴意
以前一直认为，酶（enzyme）是能 催化生物体内化学反应的一类特殊的蛋 白质，除蛋白质的一些性质外，它还有 高催化效率、高特异性、可调节性的显 著特点。 现在的研究表明，酶除有绝大部 分由蛋白质组成外，还有少量由核酸分 子组成，这些核酸分子称为核酶 （ribozyme）,主要参与RNA的加工和成 熟。
淀粉酶操作步骤：
加入物（ml） 缓冲淀粉液 37℃预温5分钟 测定管（U） 1.0 空白管（B） 1.0
稀释血清
0.2
混匀，37℃水浴7.5分钟 碘应用液 蒸馏水 1.0 6.0 1.0 6.0
混匀，660nm波长比色，读取各管吸光度。
计算： 淀粉酶单位=（AB-AU）×800÷AB 参考区间： 血清:80-180U/L；尿液:100-1200U/L。 临床意义： 急性胰腺炎8-12小时血清AMS升高，1224小时达高峰，2-5天下降，超过500U/L 有诊断意义。达350U/L是可疑。
1、128mmol/L咪唑醋酸盐缓冲液（PH8.0，25。 C ,内含12.8mmol/L醋酸镁，2.55mmol/L EDTA） 称取8.72g咪唑，溶于约950ml蒸馏水中，加 0.95gEDTA2Na及2.75g醋酸镁，待完全溶解后， 用1mmol/L 醋酸调节至pH8.0(25。C),稀释至1L， 置4。C可稳定2个月。 2、应用试剂I(115mmol/L咪唑醋酸， 2.3mmol/LEDTA,11.5mmol/L醋酸镁，23mmol/L N-乙酰半胱氨 酸,2.3mmol/LADP,5.8mmol/LAMP,11.5umol/L Ap5A,23mmol/LD-葡萄糖，