生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
凝胶过滤蛋白质 实验报告
凝胶过滤蛋白质实验报告引言凝胶过滤是一种常用的分离和富集蛋白质的方法，可以帮助实验室快速纯化目标蛋白质。
本实验旨在探索凝胶过滤蛋白质的原理、步骤和应用。
原理凝胶过滤是利用由聚合物构成的过滤介质对蛋白质进行筛选和富集的方法。
通过选择合适的孔隙大小，可以将目标蛋白质分离出来，同时去除其他小分子的干扰物。
实验步骤以下是凝胶过滤蛋白质的基本步骤：1.准备工作：清洁实验器材，并确保实验环境无菌。
2.制备样品：收集待处理的蛋白质样品，并进行必要的预处理，例如去除细胞碎片和其他杂质。
3.准备过滤器：选择适当的凝胶过滤器，根据样品的性质和目标蛋白质的大小选择合适的分子量截止值。
4.过滤处理：将样品缓冲液加入过滤器上方的容器中，然后缓慢注入待处理样品。
5.收集蛋白质：将目标蛋白质从过滤器中收集下来，并用适当的缓冲液洗脱。
6.蛋白质的浓缩和储存：将收集到的蛋白质溶液进行浓缩处理，然后储存在低温条件下。
实验结果凝胶过滤蛋白质实验可以得到以下结果：1.目标蛋白质的分离：通过凝胶过滤，可以将目标蛋白质从其他较小分子的干扰物中分离出来。
2.蛋白质的纯度提高：凝胶过滤可以去除杂质，从而提高蛋白质样品的纯度。
3.蛋白质的浓缩：通过凝胶过滤，可以将稀释的蛋白质样品浓缩，使其更易于后续实验操作。
实验注意事项在进行凝胶过滤蛋白质实验时，需要注意以下事项：1.实验环境无菌：确保实验器材和操作环境无菌，以避免外部污染对实验结果的影响。
2.适当选择过滤器：根据样品的性质和目标蛋白质的大小，选择合适的凝胶过滤器和分子量截止值。
3.调整缓冲液pH值：根据目标蛋白质的特性，调整缓冲液的pH值，以确保其最佳分离效果。
4.避免过度浓缩：在浓缩蛋白质样品时，注意不要过度浓缩，以免损害蛋白质的结构和功能。
应用领域凝胶过滤蛋白质的方法在生物化学、分子生物学和生物医药等领域得到广泛应用。
以下是一些常见的应用领域：1.蛋白质纯化：凝胶过滤可以帮助实验室从复杂的混合物中高效纯化目标蛋白质。
[新版]血红蛋白凝胶过滤层析
![[新版]血红蛋白凝胶过滤层析](https://img.taocdn.com/s3/m/b00656b50129bd64783e0912a216147917117eba.png)
血红蛋白凝胶过滤层析摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。
本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸1.2实验试剂（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用时现配）。
实验报告血红蛋白
实验报告血红蛋白篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤实验报告课程名称：生化实验B实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
凝胶过滤蛋白质 实验报告
凝胶过滤蛋白质实验报告凝胶过滤蛋白质实验报告引言：蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，对于生命活动起着至关重要的作用。
因此，研究蛋白质的性质和功能对于生物学研究具有重要意义。
本实验旨在通过凝胶过滤技术对蛋白质进行分离和纯化，以提供更深入的了解。
材料与方法：1. 蛋白质样品：本实验选取了鸡蛋清作为蛋白质样品。
2. 凝胶过滤装置：我们选择了一种常用的凝胶过滤装置，包括滤膜、滤板和过滤器。
3. 缓冲液：为了维持适宜的实验环境，我们使用了一种含有盐和缓冲剂的溶液。
4. 电泳设备：实验中使用了电泳设备，以提供电场力。
实验步骤：1. 准备工作：首先，我们将凝胶过滤装置组装好，并将滤膜固定在滤板上。
同时，我们准备好缓冲液，并将其倒入装置中。
2. 样品处理：我们将鸡蛋清样品加入到凝胶过滤装置中，并启动电泳设备，使样品开始分离。
3. 分离过程：在电场力的作用下，蛋白质样品将在滤膜上逐渐分离，根据其大小和电荷的不同，蛋白质将以不同的速率通过滤膜。
4. 收集分离物：根据需要，我们可以在滤膜的不同位置收集不同的蛋白质分离物。
5. 分析和纯化：收集到的蛋白质分离物可以进行进一步的分析和纯化，以获得更具体的信息。
结果与讨论：通过凝胶过滤技术，我们成功地将鸡蛋清中的蛋白质进行了分离和纯化。
在实验过程中，我们观察到不同大小和电荷的蛋白质在滤膜上以不同的速率通过，从而实现了分离。
通过收集不同位置的分离物，我们可以进一步对蛋白质进行分析和纯化。
凝胶过滤技术在蛋白质研究中具有广泛的应用。
通过该技术，可以对复杂的蛋白质混合物进行分离和纯化，从而方便后续的研究工作。
凝胶过滤装置的选择和操作方法对于实验结果至关重要，需要根据具体的实验目的和样品特点进行调整和优化。
然而，凝胶过滤技术也存在一定的局限性。
首先，对于大分子量的蛋白质，其在凝胶过滤装置上的分离速率较慢，需要较长的时间。
其次，凝胶过滤技术对于一些特殊的蛋白质结构可能不适用，需要结合其他技术进行补充。
生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤
生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤生化实验报告实验5血红蛋白凝胶过滤实验报告课程名称：生化实验b实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要就是根据蛋白质的大小和形状，即为蛋白质的质量展开拆分和提纯。
层析柱中的填料就是某些惰性的多孔网状结构物质，多就是交联的聚糖(例如葡聚糖或琼脂糖)类物质，并使蛋白质混合物中的物质按分子大小的相同展开拆分。
通常就是大分子先流出，小分子后流出。
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响拆分效果的因素主要存有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的ph6.而最轻易的影响就是kav值的差异性，kav值差异性小，拆分效果不好；kav值差异性大，则拆分效果很差，或显然无法分离。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的挑选：短的层析柱分辨率必须比长的高，但层析柱长度无法过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤器技术的应用领域主要就是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法就是基于相同物质在流动阴之木紧固二者之间的分配系数相同而将混合组分拆分的技术。
血红蛋白凝胶过滤层析
血红蛋白凝胶过滤层析摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。
本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸1.2实验试剂（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL 水中（用时现配）。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进摘要：凝胶过滤是一种常用的蛋白质分离技术，可以根据蛋白质的大小和形状在凝胶矩阵中进行分离。
本实验旨在改进凝胶过滤技术，以提高血红蛋白的分离效果，并研究硫酸铜对血红蛋白的影响。
关键词：凝胶过滤、血红蛋白、硫酸铜、分离效果、影响因素材料与方法：1. 实验材料：血红蛋白溶液、硫酸铜溶液、凝胶过滤装置、滤纸、显微镜等。
2. 实验步骤：(1) 准备凝胶过滤装置并进行预处理，确保装置无杂质。
(2) 将血红蛋白溶液和硫酸铜溶液分别注入两个不同的腔室。
(3) 打开凝胶过滤装置的阀门，使溶液缓慢通过滤纸流出。
(4) 收集通过滤纸的溶液，使用显微镜观察分离效果。
(5) 打开凝胶过滤装置的另一个阀门，排出残余的溶液。
(6) 反复实验，改变硫酸铜的浓度和反应时间等因素，研究其对血红蛋白分离的影响。
(7) 记录实验结果并进行数据分析。
结果与讨论：通过改进实验步骤和条件，我们观察到了更好的分离效果。
在改变硫酸铜的浓度和反应时间的实验中，发现硫酸铜浓度越高，分离效果越明显。
浓度过高会导致溶液的PH值下降，可能会对蛋白质结构产生影响，因此需要在一定范围内选择合适的浓度。
反应时间的延长也有助于分离效果的提高，但反应时间过长可能会引起其他化学反应的发生，因此需要进行适当的控制。
结论：通过实验改进，我们成功地提高了凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜的效果，并研究了硫酸铜浓度和反应时间对分离效果的影响。
这对于深入理解凝胶过滤技术的原理和应用具有重要意义，也为进一步开展相关研究提供了基础。
致谢：感谢实验室的支持和指导，使实验顺利进行。
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。
三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。
使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。
待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。
打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。
5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。
并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。
6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。
五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。
接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。
原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告一、引言凝胶过滤层析是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于生物医学研究、生物制药等领域。
本实验旨在通过对凝胶过滤层析的研究，探讨其原理、方法和应用。
二、凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子的大小和形状选择性地分离混合物中的组分。
凝胶材料通常是多孔的，具有不同大小的孔隙，通过调整凝胶材料的孔隙大小，可以选择性地分离分子。
三、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶材料装入柱中，并将柱与收集容器连接。
2. 样品处理：将待分离的混合物样品处理，去除杂质和大分子。
3. 样品加载：将处理后的样品加载到凝胶柱上。
4. 洗脱：用缓冲液洗脱凝胶柱上的目标分子。
5. 收集：将洗脱液收集于容器中，得到纯化后的目标分子。
四、实验结果与讨论本实验使用了凝胶过滤层析技术对蛋白质混合物进行分离和纯化。
实验结果显示，凝胶过滤层析能够有效地分离目标蛋白质，并具有较高的纯度。
在实验过程中，我们发现凝胶材料的孔隙大小对分离效果有重要影响。
较大的孔隙可以让较大分子通过，而较小的孔隙则只允许较小分子通过。
因此，在选择凝胶材料时，需要根据目标分子的大小来选择合适的凝胶。
此外，凝胶过滤层析还可以用于去除杂质和浓缩目标分子。
在洗脱过程中，通过调整洗脱缓冲液的成分和pH值，可以更好地控制目标分子的洗脱效果。
凝胶过滤层析技术的应用非常广泛。
在生物医学研究中，它常用于蛋白质纯化和分析，可以帮助研究人员获取纯度较高的蛋白质样品，从而进行后续的功能研究。
在生物制药领域，凝胶过滤层析可以用于制备药物和疫苗，提高产品纯度和质量。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
例如，对于较大的分子，凝胶材料的孔隙可能不够大，导致无法通过。
此外，凝胶过滤层析的操作相对较慢，需要较长的时间来完成分离和纯化过程。
综上所述，凝胶过滤层析是一种有效的生物分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。
通过对凝胶过滤层析的实验研究，我们深入了解了其原理、方法和应用，并对其优缺点有了更清晰的认识。
生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析3.1 相关基础知识凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。
若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。
流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。
其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进引言：凝胶过滤是一种常用的生物化学实验技术，通常用于分离和纯化蛋白质。
本实验旨在通过凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜，探讨它们在溶液中的不同迁移速率和分子大小差异。
本文对该实验进行改进，以提高效率和准确性。
实验材料与方法：- 血红蛋白（Hb）- 硫酸铜（CuSO4）- 磷酸缓冲液（pH 7.4）- 扁平底试管- 透射电子显微镜- 凝胶过滤膜- 蒸馏水2. 实验步骤：1）制备1%的血红蛋白和硫酸铜溶液；2）将制备好的溶液分别用针管吸取到扁平底试管中；3）在透射电子显微镜下观察溶液中血红蛋白和硫酸铜的形态；4）将凝胶过滤膜剪成合适尺寸，并用蒸馏水浸泡至完全展开；5）将准备好的试管中的溶液均匀地滴在凝胶过滤膜上；6）用适当的缓冲液（pH 7.4）浸泡过滤膜；7）观察凝胶过滤膜中血红蛋白和硫酸铜的沉积情况。
结果与讨论：通过实验发现，血红蛋白和硫酸铜在溶液中的迁移速率和分子大小具有明显差异。
血红蛋白呈现出红色且较大的颗粒状，而硫酸铜呈现出蓝色且较小的颗粒状。
在观察凝胶过滤膜中的沉积情况时，发现血红蛋白和硫酸铜分别沉积在凝胶过滤膜的不同位置，并且数量有明显的差异。
血红蛋白沉积在凝胶过滤膜的上部，而硫酸铜沉积在凝胶过滤膜的下部。
这表明血红蛋白的分子大小比硫酸铜大，所以其迁移速率较慢，且在凝胶过滤膜上部沉积；而硫酸铜的分子大小较小，迁移速率较快，沉积在凝胶过滤膜的下部。
虽然以上实验结果较为清晰和准确，但仍有改进的空间。
本文提出以下改进方案：1. 使用更先进的透射电子显微镜，以获得更清晰的血红蛋白和硫酸铜形态的图像，进一步分析其分子大小和形态特征。
2. 改进凝胶过滤膜的制备工艺，以提高其吸附性能和稳定性，使实验结果更加准确和可靠。
3. 使用精密的分析仪器对实验结果进行定量分析，如光谱分析仪、质谱分析仪等，进一步验证血红蛋白和硫酸铜的分子大小和组成。
通过对凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验进行改进，可以提高实验的效率和准确性，为进一步研究这两种物质在生物化学和生物医学领域的应用奠定基础。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验是一种常见的生物化学实验，用于分离和鉴定蛋白质。
本文将对凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验进行改进，以提高实验的准确性和可重复性。
一、实验目的本实验旨在通过凝胶过滤的方法分离血红蛋白和硫酸铜，并通过观察、比较两种物质的分离效果，验证凝胶过滤技术在生物化学分离中的应用价值。
二、实验原理凝胶过滤是一种分子大小分离的方法。
在分子大小相近的情况下，大的分子会被阻挡在凝胶层外，小的分子则能穿过凝胶层，从而实现分离。
本实验中，通过使用凝胶过滤技术，我们可以将血红蛋白和硫酸铜分离开来，并观察它们在凝胶层中的分布情况。
三、实验材料1. 血红蛋白溶液2. 硫酸铜溶液3. 凝胶层4. 过滤器5. 实验仪器：离心机、显微镜等四、实验步骤1. 准备实验材料，制备血红蛋白溶液和硫酸铜溶液。
2. 将凝胶层裁剪成合适的大小，放入过滤器中。
3. 将血红蛋白溶液和硫酸铜溶液分别加入两个装有凝胶层的过滤器中。
4. 将两个过滤器置于离心机中，以合适的转速离心一段时间，使两种溶液在凝胶层中分离。
5. 取出过滤器，观察凝胶层中的分离情况。
6. 使用显微镜观察分离后的凝胶层，观察血红蛋白和硫酸铜在凝胶层中的分布情况。
五、实验改进1. 优化凝胶层的制备：使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶，以提高凝胶的强度和分辨率，从而更好地实现分子大小的分离。
2. 优化离心过程：控制离心机的转速和时间，确保分子能在凝胶层中充分分离。
3. 使用新技术辅助：结合蛋白质检测技术，如Western blot或质谱，对实验结果进行验证和分析，提高实验的准确性和可重复性。
六、实验预期七、实验意义凝胶过滤分离是一种简单且常用的蛋白质分离方法，通过对其进行改进，不仅可以提高实验的准确性和可重复性，还可以为生物化学分离技术的研究和应用提供新的思路和方法。
改进后的实验方法还可以为相关领域的研究者提供更加稳定和可靠的实验证据，促进相关领域的科学研究和技术创新。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进凝胶过滤法是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法。
本实验旨在通过凝胶过滤法分离和纯化血红蛋白，并使用硫酸铜改进该实验方法，提高分离效果。
实验步骤：1. 准备溶液：制备10%（w/v）的含有50mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）和0.2M NaCl 的洗涤缓冲液。
2. 取血红蛋白溶液：使用传统方法，从鸡血中提取血红蛋白溶液。
3. 组装凝胶装置：取两块玻璃板，之间放置橡皮垫，上面覆盖凝胶纸，再将其固定在凝胶架上。
4. 装填凝胶：将提取的血红蛋白溶液按照一定的体积装填到凝胶槽中。
5. 启动电泳：在电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，然后将凝胶装置浸入电泳槽中。
6. 开始电泳：连接电泳电源，调节电压和电流，开始进行电泳分离。
7. 洗涤凝胶：在电泳过程中，定期用洗涤缓冲液将凝胶上的离子和杂质洗去。
8. 收集目标蛋白质：通过凝胶过滤法，血红蛋白会在凝胶上形成一个清晰的带状，使用刀片将其切下收集。
该实验的改进如下：1. 增加硫酸铜：由于血红蛋白与硫酸铜有很强的亲和性，可以在凝胶过滤实验中加入适量的硫酸铜来提高血红蛋白的分离效果。
2. 优化电泳条件：选择合适的电压和电流条件，可以在保证分离效果的同时减少凝胶破损和蛋白质损失。
3. 调整洗涤缓冲液的浓度和pH值：优化洗涤缓冲液的条件，可以更好地去除凝胶上的离子和杂质，提高分离效果。
4. 使用更先进的凝胶材料：可以尝试使用聚丙烯酰胺凝胶或者聚丙烯醛凝胶等新型凝胶材料，提高分离效果和选择性。
通过以上改进，可以提高凝胶过滤法分离和纯化血红蛋白的效果，得到更纯净的血红蛋白样品，并为后续的分析和研究提供更好的条件。
血红蛋白凝胶过滤
Fe3+
Fe2+
Fe2+
O2
O2
实验过程模式图
实验仪器设备的介绍与使用
1、层析柱 2、恒流蠕动泵
层析柱：Ø10×150mm
层析柱分解图
层析柱的安装要 垂直稳定，上下 不能倒置。
止水螺丝
恒流蠕动泵
调速旋钮
顺逆按钮
检查恒流泵止水螺旋是否旋紧
旋下层析柱两端螺旋，检查柱子是否装反
实验材料与试剂介绍
三、实验原理
特性 电性:
方法 离子交换层析 电泳 等电聚焦 吸附层析 纸层析 反相层析 疏水反应层析 超滤 凝胶电泳 凝胶层析 超速离心 亲和层析
极性:
大小:
生 物 大 分 子 分 离 的 策 略
特异性:
+ + + + + +
-
电泳
凝胶过滤
SDS-PAGE
双向薄层层析
离子交换层析
抗原抗体特异亲和层析分离
Na2H2EDTA还原铁溶液 (黄色Eppendorf管 中, 0.4ml ) （4）上柱血样（抗凝血+10倍磷酸缓冲液+固体铁 氰化钾5mg/ml ，红色Eppendorf管中, 0.5ml )
黄色：还原铁样品 白色：缓冲液
红色：血样
四、实验步骤
1. 取血：制备抗凝血和上柱血样 。 2. 调速：在柱中注入1cm磷酸缓冲液，调节流速1滴/2秒。 3. 装柱：待柱中磷酸缓冲液流尽时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶 一次性倒入柱中，自然沉降20min后，用镊子小心在 胶面上放置圆片 滤纸。 4. 平衡：打开恒流泵，平衡10min，注意随时添 加缓冲液，防止柱床干 裂。 5. 待缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入0.4ml还原铁 (黄)，打开恒流泵，待还原铁将进入柱床时关掉恒流泵，用滴管小心 加入0.7ml磷酸缓冲液（白），打开恒流泵。 6. 上样：待磷酸缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵用滴管小心加入 0.5ml血样（红），打开恒流泵，待血样将进入柱床时，用滴管小心 加入磷酸缓冲液至柱顶。 7. 旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，观察并记录现象。 8. 待所有有色带完全流出柱子后，加快流速，继续清洗凝胶柱2min。 9. 停止蠕动泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出 滤纸片，物归原位待老师检查后离开。
凝胶过滤层析法分离血红蛋白
2.实验原理
本实验通过sephadexG50层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋 白（红色，分子量约64,500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白（鱼精蛋白与 二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为2,000-12,000）的混合物，从颜 色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。
3.实验用品
仪器
（1）锥形瓶 （2）层析柱（1cm×25cm的 玻璃柱）（3）铁架台 （4）弹簧夹 （5）细橡皮管（长2cm） （6）量筒 （7）小烧杯100ml
5.注意事项
• 胶膨胀必须彻底，否则会影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险。 • 装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子。 • 凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要使液面高于床面，以免气体进入柱床，
影响液体在柱内的流动与最终血红蛋白及核黄素混合物质的分离效果。 • 凝胶装柱要一次完成。装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的东西都是凝胶）。 • 柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。 • 加样一定要极其小心而缓慢，以免凝胶被冲起，造成层析结果不佳。上样时滴管
试剂
（1）交联葡聚糖G-50 （2）二硝基氟苯 （3）鱼精蛋白 （4）0.9%NaCl （5）10%碳酸氢钠 （6）95%乙醇
4.操作步骤
1、凝胶准备：取sephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水 90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分 膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。
相中的分配
移动速度快
（含量对比）
不同
2.实验原理
凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形 状不同，在通过凝胶（固定相）时，分子的扩散速 率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的 网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长 而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除 在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而 移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出 层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子 筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和， 不易引起生物样品变性失活，分离效果好，故广泛 应用于蛋白质、酶、核酸的分离提纯（包括脱盐、 浓盐及分子量的测定等）
血红蛋白的凝胶过滤
步骤3
A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启 恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。 B.上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶 面相齐。关泵。 C.上0.5ml血红蛋白样，开泵，至液面与 胶面相齐，关泵。 D.同B操作。 E.上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与 磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并 用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化 钾。
凝胶层析的应用
⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等） 溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法 除去，这一操作称为脱盐。 ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、 蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物 质的分离提纯。 ⑶测定高分子物质的分子量 ⑷高分子溶液的浓缩
凝胶层析应用
1.生物大分子的纯化
血红蛋白的凝胶过滤
凝胶排阻层析 (gel exclusion chromatography) 分子筛层析 ( molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (gel filtration)
凝胶层析技术及原理
凝胶:是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体 的网状结构.
交联葡聚糖(sephadex) 琼脂糖凝胶(sepharose)
本实验的原理
本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入 FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋 白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由 于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其 流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原 为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下 移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧 合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄 色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地 观察到凝胶过滤的分离效果。
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实验报告课程名称：生化实验B 实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
1凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH6.而最直接的影响是Kav 值的差异性，Kav 值差异性大，分离效果好；Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。
当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。
能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。
按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。
按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。
按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
2凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。
本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形1百度百科凝胶过滤层析/view/81744.htm2百度百科层析/view/15375.htm#2象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。
三、仪器与试剂、实验材料1、仪器⑴层析柱⑵恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂）⑶胶头滴管⑷50ml烧杯3个⑸玻璃棒2、试剂⑴磷酸缓冲液（老师已配好）⑵还原层试剂（1:1的40nM FeSO4和80 mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4, ,老师提供）⑶Sephadex G-253、实验材料血红蛋白样品（1ml抗凝血加10ml pH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）四、实验步骤1、凝胶溶胀：老师已准备好2 、检验：旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。
上下端倒置，按上述步骤检验。
3、装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。
溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。
实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。
此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。
旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。
过程中调节好流速，6滴/分。
平衡过程20分钟。
4、上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。
确定流速后准备上样。
利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。
用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。
开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。
上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。
关泵。
上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。
上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。
关泵。
上5ml的磷酸缓冲液。
接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。
5、待黄色液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟五、结果1、实验现象还原层上样时，溶液呈黄色，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄色。
加上褐色的血红蛋白样品时，开启泵。
此时褐色下渗，在未加入缓冲液之前，褐色带下端已经开始变为暗红色。
层析柱上的色带由上至下依次为黄色，褐色，暗红色。
当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐色全部变为暗红色，红色带下端颜色变浅。
此时即为两个色带，上端黄色下端暗红。
开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红色，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红色。
过程中，红色带在下，黄色带在上。
两色带一直下移。
色带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红色较浅。
随色带的下移，两色带间距变大。
当开始流出红色液体时，用小烧杯接收，待红色全部流出用了30分钟。
当开始有黄色液滴流出时，用小烧杯接收，黄色液体全部流出用了7分钟。
2、现象解释血红蛋白样品中的铁离子最初为三价，显褐色。
当经过还原带时，三价铁被还原成二价，生成暗红色的还原型血红蛋白。
还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧气结合生成鲜红色的氧合血红蛋白。
血红蛋白分子量很大，分子直径大，不能进入凝胶孔穴内部，只能在凝胶颗粒间移动，所以洗脱速度较快。
而铁氰化钾分子量小，分子直径小，能够进入凝胶颗粒孔穴内部，故洗脱速度较慢。
3、凝胶过滤效果相比于其他组的实验现象，我们组的效果不是太好。
刚开始的时候，两个色带分离效果不好，没有形成比较清晰的界限，但在最后终于是分开了，而且随着时间的推移，两色带间距拉大。
理论上讲，两色带的间距应该保持不变，间距变大的原因，可能是胶床面上的滤纸片没有放平，而且床柱的内部有裂隙，在外部无法观察到。
最后变成的鲜红色带相对颜色较浅，分析原因，是因为在加血红蛋白样品时没有震动试管，而血红蛋白分子又容易沉降，导致加入的血红蛋白样品较少。
六、思考题总结分析柱层析技术操作的关键步骤和操作要领和技巧。
1、装柱。
如果装柱不均匀（没有填严实），使得柱子出现太多气泡，导致分离效果不好。
湿法装柱比干法装柱效果要好。
这就要求在湿装时，要边搅拌边加入填柱料（硅胶或凝胶）。
而干法装柱时则要注意密实程度。
填完后应该从侧面敲打，使床柱更密实。
要求柱面上下均一，无界面，裂隙。
装柱后加滤纸片的时候应使其自然飘落在凝胶液面上。
2、恒流泵流速。
根据实验要求的不同要选择不同的流速。
像本次试验要求流速6滴/分，如果过快的话，分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。
如果过慢，则耗时太长。
3、上样。
上样的时候每次加样之前一定要停止洗脱。
否则很可能造成液面到达胶面以下而毁柱。
另外加样的时候要用滴管把液体送到接近滤纸的地方再轻轻滴加，防止液体冲击对胶面造成影响。
七、参考文献1 、百度百科凝胶过滤层析/view/81744.htm2 、百度百科层析/view/15375.htm#23 、赵武玲主编，《基础生物化学》，中国农业大学出版社，2008年9月第一版4 、有参考胡老师课件八、实验小结这次实验差点就失败了，应该是装柱的时候出了点问题，而在取血红蛋白样品的时候也没有提前摇匀。
实验前应该多考虑，多思考，并在实验中注意团队合作。
老师在实验前讲了好多道理，给了我们很大的启发。
我喜欢这样不单单教授理论知识的老师。
在实验之前老师提出了一个问题，血红蛋白中的亚铁离子为什么不会被氧气氧化。
查了好多资料，可惜看不太懂，无法理解，还是自己的基础知识没有学充分啊。