质粒提取原理和方法

质粒提取原理和方法

质粒提取原理和方法

质粒DNA提取的原理及方法

碱裂解法质粒DNA提取原理

质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA如何将质粒DNA和基因组DNA 分离开来，如何去除RNA亏染，如何去除蛋白质和其它杂质。

质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：

强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细

胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS乍用下，染色体DNA与变性

蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA 从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。

影响质粒提取的因素

影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。

质粒拷贝数

质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。

下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：

质粒种类

复制起点

拷贝数

1 mL菌液质粒DNA攵获量（卩g）

pSCIOI

pSCIOI

5

0.1-0.2

pACYC

P15A

10-12

0.4-0.6

pSuperCos pMB1 10-20

0.4-1

pBR322 pMB1 15-20

0.6-1

pGEMR

Muted pMB1 300-400

6-7

pBluescriptR

ColE1

300-500

6-8 pUC

Muted pMB1

500-700

8-12

宿主菌株

宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101,

TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。

如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。

下表给出一些常用的宿主菌株种类：

EndA- Strains of E. Coli

DH5a DH1

DH21 JM106 JM109 SK2267 SRB XLO

TOP10 DH10B JM103 JM107 SK1590 MM294 Stbl2 ? XL1-Blue

BJ5182 DH20 JM105 JM108

SK1592

Select96 ?

Stbl4 ?

XL10-Gold

En dA+ Strai ns of E. Coli

C600

JM110

RR1

ABLE? C

CJ236

KW251

P2392

BL21(DE3)

HB101

TG1

TB1

ABLE? K

DH12S

LE392

PR700

BL21(DE3) pLysS

JM101

JM83

TKB1

HMS174

ES1301

M1061

Q358

BMH 71-18

All NM strai ns

All Y strai ns

菌液培养

BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操

作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600 在2.0〜3.0的菌液质粒DNA勺提取。如果使用丰富培养基，如TB, 2 x YT培养基，请保证OD600 不超过3.0。菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。

培养方式

如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12〜16小时。

如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：

挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。

抗生素浓度的选择

对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。

各种抗生素的工作浓度请参照下表：

抗生素

溶解性

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒氨苄青霉素

50 mg/mL（溶于水）

-20 °C

20 卩g/mL

60 卩g/mL

羧苄青霉素

50 mg/mL溶于水

-20 C

20 卩g/mL

60 卩g/mL

氯霉素

34 mg/mL溶于无水乙醇

-20 C

25 卩g/mL

170 [1 g/mL

卡那霉素

10 mg/mL溶于水

-20 °C

10 [1 g/mL

50 i g/mL

链霉素