细胞研究方法和手段

三、细胞融合
定义（cell fusion）两个或多个细胞融合成一个细胞的现象。
类型：自发型、人工型、
人工融合的条件：
a.灭活病毒仙台病毒
b.化学试剂PEG
c.电融合（低压聚集成串，高压脉冲融合）
步骤：异核体细胞→杂种细胞。
Exercises
人 鼠 细 胞 杂 交 实 验
细胞融合的应用----单克隆抗体技术
三、体外DNA扩增法 (PCR)
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)
链式反应？ 方法： 1.反应液成分：PCR缓冲液、引物、dNTP、模板、水、
DNA聚合酶（Taq酶） PCR法优点：①倍增量大②反应时间短③灵敏度高 PCR进展：扩增长度：200~10Kbp ，方法增多。
1.差速离心法
原理：大小、形状分离
①1,000g，10分钟→细胞核或细胞。 ②8,000g，20分钟→线粒体、溶酶体、过 氧化物酶体。 ③15,000g，1小时→沉淀细胞膜。 ④100,000g，3小时→沉淀微粒体 ⑥150,000g →沉淀核糖体和病毒。
问题？
差速离心法分离不纯：某些慢沉降颗粒被裹到快沉降颗
→三胚层分化 外胚层成神经、表皮等。 中胚层发育为肌、骨等。 内胚层发育成消化道及肺的上皮等。
→组织→器官→系统→胚胎
①全能干细胞（totipotent stem cell）：如受精卵、植物细
胞、动物初期卵裂细胞（人类八细胞期）能形成个体。 ②多能干细胞（pluripotent stem cell）：如：胚胎干细胞、 能形成多种细胞和器官。 胚胎干细胞（embryo stem cell）指囊胚内细胞团， 成体干细胞几乎存在于所有组织如：骨髓、外周血、骨骼 肌、肝、胰、角膜、视网膜、牙髓等 ③单能干细胞:成体干细胞能，能形成少数几种细胞和组织。
a.离心法：按大小、密度离心分离。 b.吸附法：
材料粘附分离法：玻璃或塑料。 抗原抗体吸附分离法：抗原对抗体
c.流式细胞仪
流程：
荧光标记→分散细胞 →细胞单个通过→激光照射 →接受计算机识别
→充电→分选→收集
用途：
细 胞 群 类 型 、 细 胞 内 的 DNA 、 RNA、蛋白质的含量、 细胞的生命活动等
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分类：
普通PAGE、 SDS- PAGE、等电聚焦PAGE、双向PAGE。
①普通聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 原理：丙烯酰胺单体用甲叉丙烯酰胺在催化剂(过硫酸铵、
TEMED)交链成筛状物。
特点：复杂、贵、分离范围小、加样量大、分辨率高等。
②SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：十二烷基硫酸钠（SDS ）在还原剂二硫苏糖醇(DTT)
粒的沉降块中。
处理方法：将产物重悬→反复离心→可纯化。
2.速度沉降法 (区带离心法)
优点:不易扩散、分离效果好 方法：
管预铺密度梯度溶液（通常；蔗糖 5％～20％) →细胞匀浆液溶于稀盐溶 液→铺薄层→离心→细胞器呈区带 移动。
3．平衡沉降法
问题？
原理：密度与浮力分离 方法：氯化铯溶液与细胞匀浆混合→超
柱 层 析 分 离 原 理
柱层析分类：所选择的充填颗粒
离子交换层析、 凝胶过滤层析 亲和性层析、 疏水性层析 例1：离子交换层析：充填颗粒带有正电或负电。
例2：凝胶过滤层析：层析柱装满多孔性的凝胶颗粒。
三、蛋白质电泳法 原理:带电荷的分子在电场中的运动。
电泳分类：根据支持物分类：
琼脂糖凝胶电泳
离体时间与改变成正比。应该注意！
细胞培养
培养条件：无菌、营养物、刺激因子、温度、PH值等。
分类：原代培养、传代培养。 （一）原代培养： 狭义定义：培养1代细胞；广义定义：培养1~10代细胞。
过程：
①取材，年龄与材料 ②剪碎与过滤
③消化（胰蛋白酶、胶原酶）。
④后续处理（离心、清洗、接种、细胞分选）
生长状况：贴壁现象、接触抑制现象。
帮助下，SDS与蛋白质肽链结合成梭状，SDS的负电荷掩盖了 蛋白质的电荷，
梭状物只与肽链的分子量有关。
问题？
③等电聚焦电泳 原理：
蛋白质的氨基酸残基解离与是等电点(PI) 两性电解质（ampholyte）在电场中展开成PH梯度， 蛋白质在电场位置:PH＞ PI, 带正; PH＜ PI, 带负； PH= PI，不带电 。
（二）分类：
分类1:全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。 分类2:胚胎干细胞、成体干细胞 。
胚胎发育过程简介
精子与卵细胞结合→受精卵→桑椹胚（8-16细胞团）
→囊胚（32-64中空细胞团）
囊胚外层为滋养层细胞→胎盘 囊胚腔→羊膜腔
内细胞团→原肠胚（两胚层）→
囊胚→原肠胚（两胚层）→中胚层形成
优缺:射线灵敏度很高，? 定位检测法：放射性自显影法。
放射性自显影法：
步骤：
细胞脉冲标记→清洗未标记的同位素→制片→涂核子乳胶 →感光→显影→定影→根据银颗粒位置和数量推出细胞中标记 分子的分布和数量。
四、检测活细胞内部分子状态的方法
分类：微电极法、膜片钳记录法 微电极法：是尖端直径＜1um的玻璃电极，刺入
1975年英国学者Milstein和Kohler发明。
方法：小鼠骨髓瘤细胞与小鼠B淋巴细胞（脾细胞免疫
过）用聚乙二醇融合。
融合后的杂交瘤细胞具有双亲特性：
一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体， 另一方面像瘤细胞一样，
无限增殖、分泌大量抗体。
四、干细胞培养
（一）干细胞定义：能长期的自我更新并能产生至
少一种高度分化的子代细胞的细胞。
10代内培养危机 细胞系的诞生
细胞系特点：遗传物质不变，有接触抑制现象，细胞特点 不变：如成纤维细胞仍分泌胶原。
40~50内的培养危机 连续细胞系(细胞株)的诞生, 或直接从肿瘤组织中培养出
细胞株特点：遗传物质改变 (染色体有亚二倍体等畸变), 无接触抑制现象，细胞特点改变：细胞已经转化 ★细胞克隆
一代细胞生长过程：贴壁期、潜伏期、指数增长期、平台期
类型：悬浮细胞，贴壁型。 形态：梭型、上皮型、球型、游走型。
生长状况：贴壁现象? 接触抑制现象? 形态：梭型、上皮型、球型、游走型?
生长状况：贴壁现象? 接触抑制现象? 形态：梭型、上皮型、球型、游走型?
（二）传代培养：
例：传代培养贴壁细胞和悬浮细胞传代的操作步骤
☆该法是唯一能即时研究膜单一蛋白分子功能的方法。
六、向细胞内导入分子的方法
分类：显微注射法、 电穿孔法、 脂质体 DEAE葡聚糖转染法、磷酸钙转染法。
①显微注射法：如：将DNA等注入ES细胞
①显微注射法 ②电穿孔法 ③脂质体
④电流
第五节 细胞内功能基因组学研究技术
引言：分子生物学技术越来越重要。主要对DNA的技术 方法分类：
内切酶切口分类：粘性末端或平头末端
①粘性末端切口产生5’端：EcoR Ⅰ ②粘性末端切口产生3’端：Kpn I ③平头末端切口：EcoR V
二、DNA电泳分离法
①琼脂糖凝胶电泳：操作简单，分辨率低，分离片断 大；琼脂糖浓度从0.6%~2.0％,分离DNA片段从0.1kb~ 20kb。 ②丙烯酰胺凝胶电泳：操作复杂，分辨率高，可分离 仅相差一个碱基的DNA片段，丙烯酰胺浓度5％~20％， 分离DNA500～10bp。
速和长时间离心→氯化铯溶液形成密度梯 度→细胞器向等密度移动形成区带→分离
优缺点：分离纯度，但仪器和费用贵。
比较差速离心法、速度沉降法、平衡沉降法的优缺点?
二、层析法分离蛋白质
原理：由于不同的组分在两种液面中的分配不同，而随着
液体的流动彼此分离的现象。
类型：以支持物的类型分
纸层析：（滤纸） 薄层层析：（纤维素或硅胶） 例：糖类、氨基酸分离等小分子物质 柱层析：（玻璃、塑料、不锈钢颗粒） 例: 分离蛋白质、糖类、核酸等大分子物质。
2.反应过程:
①模板DNA变性，95℃, 1’。 ②模板与引物复性，30~60 ℃ ③DNA合成 延伸、72℃ ④循环①②③步骤。35循环 ⑤反应总延ry）的定义：将一个基因组或表达基因组 的全部基因分散后插入载体中形成的克隆群称该基因 组的DNA或cDNA。第二节 细胞的分离和培养
一、细胞分选(cell sorting )
步骤：组织取材→细胞总分离→细胞类型分离
①组织取材：年龄小容易，肾、肌肉、肿瘤等。 ②细胞总分离： 剪碎组织→酶的消化（胰蛋白酶、胶原酶、EDTA)→过 滤→离心→悬浮→细胞悬液。
③细胞类型分离法：
分类：离心法、吸附法、流式细胞仪法、 激光捕捉显微切割技术。的作用：已知或未知基因的获得 、染色体
步移法作图、物种基因的档案等。
分子生物学名词：
酶切、连接、载体、宿主、克隆、转化、转染、cDNA cDNA（complementary DNA）:在逆转录酶作用下以mRND为模板转
录的DNA。
宿主:能使重组DNA复制繁殖的生命体。
如细菌（大肠杆菌、DH5α）、酵母、昆虫细胞、哺育类细胞 （成纤维细胞）。
d.激光捕捉显微切割技术
原理：显微镜操作下，透明薄塑膜覆盖组织片→激光 精确切割→激光捕捉→溶膜获细胞。 优缺点：精密定位细胞，粗步、量少。
二、细胞培养(cell culture)
细胞培养≈组织培养 优点： ①细胞处理条件能严格控制，体内难。 ②细胞可大量、长期提供。 缺点：
离体后细胞失去与体液和神经体液的调节环境， 细胞间的相互作用消失。细胞的形态、活动和基因会 改变。
（三）干细胞培养实验方法：
①干细胞分离： ②干细胞培养： 培养液：DMEM、TCM-199、F-12等。 附加因子： 促生长因子 如FGF；抑制分化因子 如：LIF 补充方法： a.用滋养层细胞提供：有成纤维细胞，射线处理。 b.用滋养层细胞提取液。