基础生物化学实验-米氏常数Km
基础生物化学名词解释
1.碱基互补原则：在形成双螺旋结构的过程中，由于各种碱基的大小与结构的不同，使得碱基之间的互补配对只能在G…C（或C…G）和A…T（或T…A）之间进行，这种碱基配对的规律就称为碱基配对规律（互补规律）。
2.核酸的变性：当呈双螺旋结构的DNA溶液缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链DNA 便脱解为单链，这叫做核酸的“溶解”或变性。
3.核酸的复性：在适宜的温度下，分散开的两条DNA链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。
这个DNA螺旋的重组过程称为“复性”。
4.增色效应：当DNA从双螺旋结构变为单链的无规则卷曲状态时，它在260nm处的吸收便增加，这叫“增色效应”。
5.减色效应：DNA在260nm处的光密度比在DNA分子中的各个碱基在260nm处吸收的光密度的总和小得多（约少35%~40%）, 这现象称为“减色效应”。
6退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。
7.DNA的熔解温度（Tm值）：引起DNA发生“熔解”的温度变化范围只不过几度，这个温度变化范围的中点称为熔解温度（Tm）。
8.环化核苷酸：单核苷酸中的磷酸基分别与戊糖的3’-OH及5’-OH形成酯键，这种磷酸内酯的结构称为环化核苷酸。
9.碱基堆积力：各个碱基堆积在一起，产生碱基间的范德华引力，对稳定双螺旋结构起一定的作用。
10.顺反子：遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子11.核小体：DNA双螺旋盘绕在组蛋白八聚体上形成核小体。
核小体是染色体的基本结构单位。
12．两性离子：指在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。
13．氨基酸残基：肽链中的氨基酸分子由于参加肽键的形成已不完整，每一个氨基酸单位叫氨基酸残基。
14．氨基酸的等电点：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值，用符号pI表示。
15．肽键：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基脱去一分子水缩合而形成的共价键. 16．肽单位：多肽链主骨架的重复单位Cα-CO-NH- Cα，包括肽键和两个α-碳原子。
基础生物化学习题生物化学习题集
基础生物化学习题生物化学习题集第一章核酸的结构和功能一、选择题1、热变性的DNA分子在适当条件下可以复性，条件之一是（）A、骤然冷却B、缓慢冷却C、浓缩D、加入浓的无机盐2、在适宜条件下，核酸分子两条链通过杂交作用可自行形成双螺旋，取决于（）A、DNA的Tm值B、序列的重复程度C、核酸链的长短D、碱基序列的互补3、核酸中核苷酸之间的连接方式是：（）A、2’，5’—磷酸二酯键B、氢键C、3’，5’—磷酸二酯键D、糖苷键4、tRNA的分子结构特征是：（）A、有反密码环和3’—端有—CCA序列B、有密码环C、有反密码环和5’—端有—CCA序列D、5’—端有—CCA序列5、下列关于DNA分子中的碱基组成的定量关系哪个是不正确的？（）A、C+A=G+TB、C=GC、A=TD、C+G=A+T6、下面关于Watson-Crick DNA双螺旋结构模型的叙述中哪一项是正确的？（）A、两条单链的走向是反平行的B、碱基A和G配对C、碱基之间共价结合D、磷酸戊糖主链位于双螺旋内侧7、具5’－CpGpGpTpAp-3’顺序的单链DNA能与下列哪种RNA杂交? （）A、5’-GpCpCpAp-3’B、5’-GpCpCpApUp-3’C、5’-UpApCpCpGp-3’D、5’-TpApCpCpGp-3’8、RNA和DNA彻底水解后的产物（）A、核糖相同，部分碱基不同B、碱基相同，核糖不同C、碱基不同，核糖不同D、碱基不同，核糖相同9、下列关于mRNA描述哪项是错误的？（）A、原核细胞的mRNA在翻译开始前需加“PolyA”尾巴。
B、真核细胞mRNA在3’端有特殊的“尾巴”结构C、真核细胞mRNA在5’端有特殊的“帽子”结构10、tRNA的三级结构是（）A、三叶草叶形结构B、倒L形结构C、双螺旋结构D、发夹结构11、维系DNA双螺旋稳定的最主要的力是（）A、氢键B、离子键C、碱基堆积力 D范德华力12、下列关于DNA的双螺旋二级结构稳定的因素中哪一项是不正确的？（）A、3'，5'－磷酸二酯键C、互补碱基对之间的氢键B、碱基堆积力D、磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键13、Tm是指( )的温度A、双螺旋DNA达到完全变性时B、双螺旋DNA开始变性时C、双螺旋DNA结构失去1/2时D、双螺旋结构失去1/4时14、稀有核苷酸碱基主要见于( )A、DNAB、mRNAC、tRNAD、rRNA15、双链DNA的解链温度的增加，提示其中含量高的是（）A、A和GB、C和TC、A和TD、C和G16、核酸变性后，可发生哪种效应？（）A、减色效应B、增色效应C、失去对紫外线的吸收能力D、最大吸收峰波长发生转移17、某双链DNA纯样品含15％的A，该样品中G的含量为（）A、35％B、15％C、30％D、20％二、是非题（在题后括号内打√或×）1、杂交双链是指DNA双链分开后两股单链的重新结合。
km值名词解释
km值名词解释在生物化学和酶催化反应中，KM（又称为米氏常数）是一个用来度量酶与底物之间的亲和力的常数。
KM的全称为Michaelis-Menten常数，取自Hans Michaelis和Maud Menten这两位德国生物化学家的名字，他们在1913年提出了Michaelis-Menten方程，描述了酶与底物之间的动力学关系。
KM的数值表示了酶与底物结合的亲和力，具体来说，KM越小，酶对底物的亲和力越强，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越快。
反之，KM越大，酶对底物的亲和力越弱，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越慢。
KM的定义是，在酶催化反应中，当酶底物复合物的浓度为一半时，即酶底物反应速率的一半时，底物的浓度就等于KM。
换句话说，KM可以看作是底物浓度的一个度量，当底物浓度等于KM时，酶的速率只有最大速率的一半。
KM的单位通常是摩尔/升（M），但在实验室常用的浓度单位为摩尔/升时，KM的数值很小，通常在10^-3至10^-6 M之间。
因此，在实际中，常常使用KM的对数，即pKM（-logKM）来表示。
KM的值是由酶-底物系统的性质决定的，包括酶的结构、底物的结构以及反应条件等。
通常而言，底物结构与酶的活性位点的互补性越好，底物对酶的亲和力越大，KM的值越小。
通过测定酶在不同底物浓度下的速率，可以得到KM的值。
KM的测定对于了解酶催化反应的机制、酶的特性以及酶底物的相互作用非常重要。
在药物研发和酶工程中，对KM的测量和调控也非常关键，可以帮助优化酶的催化效率和选择性。
总之，KM是用来度量酶与底物之间亲和力的常数，表示了底物浓度等于KM时酶的速率达到最大速率的一半。
KM的值受到酶的结构、底物的结构和反应条件等因素的影响，通过测定酶在不同底物浓度下的速率可以获得KM的值，进而了解酶催化反应的机制和优化酶的性能。
生物化学笔记
生物化学一．名词解释米氏常数（Km）磷酸戊糖途径调节子酶辅助因子cori循环与巴斯德效应滚动环复制二．结构式TPCK 尼克酰胺GC配对IP3三．填空1, 蔗糖是否为还原糖-----。
2，糖苷键的两种类型-----和-----。
3，DNA的一条链序列为GTCAATG，那么另一条链的序列为-----。
4，-----常数表征酶的催化效率。
5，ρ因子的催化活性是-----和-----。
6，常见的遗传缺陷病有-----，-----，-----，-----；常见的放射性标记的同位素是-----，-----，-----，-----。
7，DNA复制过程中动物是以-----为能源，E. Coli 以-----为能源。
8，生物体中产能最多的生化反应过程是-----。
9，-----发现TCA循环，-----发现化学渗透学说。
10，真核生物rRNA拼接过程中左端的拼接点顺序为-----右端为-----，切除-----结构。
11，生长激素是由-----产生的。
12，E．Coli DNA Pol I 经酶切，得到大小片段，其中大片段具有-----酶活性和-----酶活性，小片段具有-----酶活性。
13，必需脂肪酸有-----和-----。
四．回答1，作动力学曲线区分酶的可逆性抑制与不可逆抑制？2，比较ATP与ppi在磷酸键及生物学功能方面的异同。
3，真核生物至少需要31种tRNA才能识别61种密码子，而线粒体中tRNA只有22种，为什么？4，阐明衰减子对操纵子的调控。
5，糖酵解和糖异生过程中涉及的不可逆反应和限速步骤。
五．计算1，反竟争抑制和米氏方程。
2，酶活力，比活力，酶浓度。
3，DNA半保留复制。
15NDNA在14N培养基上培养一代后，14NDNA与14N-15NDNA杂交分子之比是多少？4，正常DNA的超螺旋密度为-0.05，在无拓扑异构酶条件下当复制到超螺旋密度为0.07时，由于正超螺旋的阻力而不能继续复制，求此时的复制百分数。
生物化学实验简答题
生物化学实验简答题1 简述透析的原理，影响透析的因素及透析的应用。
透析是一种利用小分子能通过，大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。
影响透析的因素主要有膜、溶剂（水溶液、大分子溶液）、物理条件（温度、压力）、董南膜平衡等。
透析主要用于将大分子物质和小分子物质分开，如蛋白质的分离纯化。
2 请设计一项实验，分离并鉴定某一微生物中的游离氨基酸。
如何分析未知样品的氨基酸成分？利用纸层析法分离鉴定该微生物中的游离氨基酸。
实验所需器材包括层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿和层析滤纸，实验所需试剂包括扩展剂、氨基酸溶液（各标准氨基酸溶液和待测氨基酸溶液）和显色液（0.1%水合茚三酮正丁醇溶液）。
实验操作步骤如下一取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘1.5-2cm处用铅笔划一条直线，在此直线上以相同间距作出记号。
二点样用毛细血管将各氨基酸样品分别点在所作记号的位置上，待干燥后，可重复点3次。
三扩展用线将滤纸缝成筒状，将滤纸直立于盛有扩展剂的培养皿中扩展。
待溶剂上升至距滤纸上端边缘1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或吹风机热风吹干。
四显色用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，用热风吹干显出层析斑点。
五计算各氨基酸Rf值。
滤纸上的层析斑点图即是对氨基酸分离的结果，通过比较各标准氨基酸Rf值和待测氨基酸的Rf值即可鉴别待测的游离氨基酸。
3 层析技术包括哪几类？请简要介绍凝胶层析的原理。
层析技术包括吸附层析、离子交换层析、分配层析、薄层层析、凝胶层析和亲和层析。
凝胶层析的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。
固定相是凝胶，各组分分子的大小不同，而在凝胶上受阻的程度不同，从而分层。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，移动速度快，先被洗出层析柱；小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱。
生物化学习题及答案_酶
酶（一）名词解释值）1．米氏常数（Km2．底物专一性（substrate specificity）3．辅基（prosthetic group）4．单体酶（monomeric enzyme）5．寡聚酶（oligomeric enzyme）6．多酶体系（multienzyme system）7．激活剂（activator）8．抑制剂（inhibitor inhibiton）9．变构酶（allosteric enzyme）10．同工酶（isozyme）11．诱导酶（induced enzyme）12．酶原（zymogen）13．酶的比活力（enzymatic compare energy）14．活性中心（active center）（二）英文缩写符号1．NAD+（nicotinamide adenine dinucleotide）2．FAD（flavin adenine dinucleotide）3．THFA（tetrahydrofolic acid）4．NADP+（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）5．FMN（flavin mononucleotide）6．CoA（coenzyme A）7．ACP（acyl carrier protein）8．BCCP（biotin carboxyl carrier protein）9．PLP（pyridoxal phosphate）（三）填空题1．酶是产生的，具有催化活性的。
2．酶具有、、和等催化特点。
3．影响酶促反应速度的因素有、、、、和。
4．胰凝乳蛋白酶的活性中心主要含有、、和基，三者构成一个氢键体系，使其中的上的成为强烈的亲核基团，此系统称为系统或。
5．与酶催化的高效率有关的因素有、、、、等。
6．丙二酸和戊二酸都是琥珀酸脱氢酶的抑制剂。
7．变构酶的特点是：（1），（2），它不符合一般的，当以V对[S]作图时，它表现出型曲线，而非曲线。
大学课程生物化学实验km课件
一、实验目的 1．了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2．学习测定米氏常数的原理和方法。
二、实验原理
酶促反应动力学
研究各种因素对酶促反应速度的影响。
影响因素包括有
酶浓度、底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂等。
研究前提
I. 单底物、单产物反应 II. 酶促反应速度用单位时间内底物的消耗量和产
底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方 程 式 ， 简 称 米 氏 方 程 式 (Michaelis equation)。
Ｖ ＝ Vmax[S]
Km + [S]
米－曼氏方程式推导基于两个假设：
①反应刚刚开始，产物的生成量极少，逆反应可 不予考虑。
②［S］超过［E］，［S］的变化可忽略不计。
Km与Vmax的意义
3. Km是酶的特征性常数之一
4. Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与 酶浓度成正比。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶
的转换数(turnover number)，即动力学常 数K3。
Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝 氏(Lineweaver- Burk)作图法
每个三角瓶中各加人酚酞20滴，用0.1 mol／LNaOH 滴定至粉红色，保持颜色在30秒内不退色，记下所用 NaOH的毫升数。每个小锥型瓶中样品的滴定终点颜 色应当一致。
6．其它浓度的酪蛋白溶液反应速度的测定重复2－5 步骤。
五、数据处理
1．初速度的计算 用增加的滴定度(标准NaOH滴定体积× 0.1摩 尔浓度×14.008)对时间作图，测定不同底物 浓度的初速度。
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
HHU Hunan PRC | 吴黎明
1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
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3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
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在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
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碱性磷酸酶米氏常数测定
（二）酶活性（U/L） 1. 酶活性单位：在特定条件下，酶促反应在 单位时间内生成一定量的产物或消耗一定 量的底物所需的酶量。 2. 酶活性国际单位（IU）：按照国际酶学会 议的规定，1个酶活力单位是指在25℃、测 量的最适条件（指最适pH、温度等）下，1 分钟内能引起1微摩尔底物转化的酶量。
课后复习题
5以各管基质浓度的倒数标以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1v作纵坐标作图求出km结果与计算在37保温分钟每生成活性单位以标准曲线查出释放酚量g即可算出酶活性
碱性磷酸酶米氏常数的测定
浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室
[目的与要求] 1. 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方 法及意义。 2. 学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反 应动力学的理解。
0
5
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40
(2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。 (3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 酚标准曲线
2. 底物浓度对酶促反应速度的影响
最终基质浓度单位：µmol/ml (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上 述各管置37℃水浴中准确保温15分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。
[结果与计算] 在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶 活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可 算出酶活性。
100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100× （1/1000）=释放的酚量（μg） （释放酚量（μg）、1/0.1--0.1为实际取血清0.1ml、 100为100ml血清、1000为μg变为mg。）
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐 标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方 向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以 正确求得该酶的Km值，如图所示。
大学生物化学实验名词解释（2）
名词解释1 DNS试剂:3,5-二硝基水杨酸试剂,与还原糖共热后被还原成棕黑色的化合物2 Km:米氏常数，是酶的一个特征常数大小反映了酶与底物亲和力的强弱。
Vmax：是酶被底物饱和时的反应速度，Km值的物理意义为反应达到1/2Vmax的底物浓度再增加底物对反应速度没有什么影响。
反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。
3 还原糖：是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的蛋汤和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。
4 gel filtrat ion:凝胶层析法，是利用凝胶吧分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。
5 Acr：丙烯酰胺，可与少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂的作用下聚合交联而成三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。
6 酶的比活力：在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
7 酶的活力单位:是指在特定条件下(25℃、最适的pH值和底物浓度),每分钟可催化1微摩尔底物转化所需要的酶量。
8 电泳：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。
9 层析（色谱）：用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，使混合物各组分以不同速度移动，从而达到分离的一种物理方法。
10 分子筛效应：凝胶本身具有三维网状结构,大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大,小分子通过时阻力较小。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队,凝胶表现分子筛效应。
11 电泳的原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
大学基础生物化学考试(试卷编号111)
大学基础生物化学考试(试卷编号111)1.[单选题]丙酮酸脱氢酶复合体中最终接受底物脱下的2H的辅助因子是( )A)FADB)CoAC)NAD+D)TPP答案:C解析:教材P181,α-酮戊二酸经α-酮戊二酸脱氢酶复合体转变为琥珀酰辅酶A，脱下的H由NAD+接受2.[单选题]糖酵解时( )代谢物提供Pi使ADP生成ATPA)3-磷酸甘油醛PEPB)1，3-二磷酸甘油酸及PEPC)1-磷酸葡萄糖及1，6-二磷酸果糖D)6-磷酸葡萄糖及2-磷酸甘油酸答案:B解析:A项未生成ATP;B项，PEP全称磷酸烯醇式丙酮酸，含有一个磷酸，1，3-二磷酸甘油酸发生底物水平磷酸化，脱下一个Pi，提供给ADP，合成ATP;C、D项，需要消耗ATP，消耗一个Pi具体可查看生化教材P172的图7-113.[单选题]天冬氨酸的 pK1=2.09，pK2=3.86，pK3=9.82,则其等电点为 ( )A)2.09B)2.97C)3.86D)6.84答案:B解析:酸性氨基酸等电点为（PK1+PK2）,直接记忆Asp是2.97，与书上表格一致4.[单选题]必需氨基酸是这样一些氨基酸（ ）A)可由其他氨基酸转变而来B)可由三羧酸循环中间物转变而来C)可由脂肪的甘油转变而来D)体内不能合成,只能由食物提供答案:D解析:5.[单选题]对于哺乳动物来讲，下列哪一种氨基酸不是必需氨基酸 ( )A)PheB)Lys解析:酪氨酸不属于必需氨基酸6.[单选题]血清中的谷草转氨酶（GOT）活性异常升高，表明下列（ ）细胞可能损伤A)心肌细胞B)肝细胞C)肺细胞D)肾细胞答案:A解析:原因未知，书上没有，百度多方面查找，确实是心肌细胞心肌梗死或者心肌炎会引起血清中的谷草转氨酶升高7.[单选题]下列选项中不属于生物催化剂是（ ）A)核酶B)淀粉酶C)环糊精D)过氧化氢酶答案:C解析:环糊精是一类低聚糖的总称8.[单选题]植物合成蔗糖的主要酶是( )A)蔗糖合酶B)蔗糖磷酸化酶C)磷酸蔗糖合酶D)转化酶答案:C解析:A、C都是植物合成蔗糖所需的酶，A项主要是在非光合组织中，C项主要是在光和组织中，二者中磷酸蔗糖合酶为主要酶参考教材P1939.[单选题]由己糖激酶催化的反应的逆反应所需要的酶是( )A)果糖二磷酸酶B)葡萄糖-6-磷酸脂酶C)磷酸果糖激酶D)磷酸化酶答案:B解析:糖异生作用主要沿着糖酵解逆途径进行，但不是糖酵解的直接逆反应( P189 )10.[单选题]需要引物分子参与生物合成反应的有( )A)酮体生成B)蔗糖合成解析:参考教材P19611.[单选题]二硝基苯酚能抑制下列细胞功能的是( )A)糖酵解B)肝糖异生C)氧化磷酸化D)柠檬酸循环答案:C解析:氧化磷酸化解偶联剂有2，4-二硝基苯酚（DNP）、双香豆素、羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼、天然的解偶联蛋白（UCP）12.[单选题]在 pH6.0 时，带正净电荷的氨基酸是 ( )A)GluB)ArgC)LeuD)Ala答案:B解析:Arg的等电点是10.76，PH6的条件下，精氨酸带正电。
从米氏常数_Km_的测定谈药学生物化学实验教学
在生物化学学生实验及酶学实验中, 酶的特征 常数 米氏 常数 Km 的 测定 是必 须做 的一 个试验。 但是该实验对实验者在操作中的要求较高。通过几 年的教学实验, 笔者发现学生往往很难得到理想的 结果。不是因为学生的能力差 , 而是实验本身在设 计上有值得改进之处。 一、 实验中存在的问题 生物化学实验教学中 , 多年来药学院校一直采 用的教材是 生物化学实验与指导 ( 中国医药科技 出版社, 韦平和主编 ) 。米氏常数的实验是测定酵母 中蔗糖酶的 Km, 通常将它作为考试实验, 学生在做 实验时更紧张, 更容易出现问题, 常常不能取得预期 的结果。 该实验原理为: 蔗糖酶水解蔗糖生成葡萄糖, 葡 萄糖与二硝基水杨酸反应生成有颜色的物质, 经比 色分析, 测定生成的还原性葡萄糖的含量, 以确定酶 的反应活力。 在该实验教材中 , 显色是以 3 ml 的二硝基水杨 酸与葡萄糖进行反应 , 溶液稀释至 25 ml, 然后进行 显色沉淀以确定蔗糖 水解的反应初速 度。以 5 ml 0 1mol/ L NaOH 终止酶反应。然而使用 这种方法 , 大部分学生难以在初次做酶学 实验获得理想 的结 果。 二、 教学中改进 基于酶学实验的特性和学生实验的特点, 在教 学中首先做了如下改进: 1 将 3 ml 二硝基水杨酸改为 1 ml 进行反应。 因为加入 3 ml 二硝基水杨酸后反应总体积为 5 ml, 已经适合做比色测定 , 并且不浪费。
参考文献 [ 1] 韦平和 . 生物 化学实 验与 指导 [ M] . 北京 : 中国 医药 出 版社 , 2003, 51 59. [ 2] 张龙翔 , 张庭 芳 , 李令媛 生化实 验方 法和 技术 ( 第 二 版 ) [ M] . 北京 : 高等教育出版社 , 1997, 143 151. [ 3] 李 艳利 , 冯东举 医学院校研 究室分子生 物学初探 [ J] . 微生物通报 , 2004, 31: 137 139. [ 4] 王镜岩 , 朱圣 庚 , 徐长 法 生 物 化学 ( 第三 版 ) [ M ] . 北 京 : 高等教育出版社 , 2002, 351 383. [ 5] Reithel J Ureases The Enzymes, Vol IV, Boyer P D, ed, 3rd, NewYork, London; Academic Press, 1971: 1 21
基础生物化学试题及答案(1)
《基础生物化学》试题一一、判断题（正确的画“√”，错的画“×”，填入答题框。
每题1分，共20分）1、DNA是遗传物质，而RNA则不是。
2、天然氨基酸都有一个不对称α-碳原子。
3、蛋白质降解的泛肽途径是一个耗能的过程，而蛋白酶对蛋白质的水解不需要ATP。
4、酶的最适温度是酶的一个特征性常数。
5、糖异生途径是由相同的一批酶催化的糖酵解途径的逆转。
6、哺乳动物无氧下不能存活，因为葡萄糖酵解不能合成ATP。
7、DNA聚合酶和RNA聚合酶的催化反应都需要引物。
8、变性后的蛋白质其分子量也发生改变。
9、tRNA的二级结构是倒L型。
10、端粒酶是一种反转录酶。
11、原核细胞新生肽链N端第一个残基为fMet，真核细胞新生肽链N端为Met。
12、DNA复制与转录的共同点在于都是以双链DNA为模板，以半保留方式进行，最后形成链状产物。
13、对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。
14、对于任一双链DNA分子来说，分子中的G和C的含量愈高，其熔点（Tm）值愈大。
15、DNA损伤重组修复可将损伤部位彻底修复。
16、蛋白质在小于等电点的pH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的pH溶液中将向阴极移动。
17、酮体是在肝内合成，肝外利用。
18、镰刀型红细胞贫血病是一种先天性遗传病，其病因是由于血红蛋白的代谢发生障碍。
19、基因表达的最终产物都是蛋白质。
20、脂肪酸的从头合成需要NADPH+H+作为还原反应的供氢体。
二、单项选择题（请将正确答案填在答题框内。
每题1分，共30分）1、NAD+在酶促反应中转移（）A、氨基B、氧原子C、羧基D、氢原子2、参与转录的酶是（）。
A、依赖DNA的RNA聚合酶B、依赖DNA的DNA聚合酶C、依赖RNA的DNA聚合酶D、依赖RNA的RNA聚合酶3、米氏常数Km是一个可以用来度量（）。
A、酶和底物亲和力大小的常数B、酶促反应速度大小的常数C、酶被底物饱和程度的常数D、酶的稳定性的常数4、某双链DNA纯样品含15%的A，该样品中G的含量为（）。
基础生物化学新—名词解释
基础生物化学新—名词解释单核苷酸：核苷与磷酸缩合生成的磷酸酯称之单核苷酸。
磷酸二酯键：单核苷酸中，核苷的戊糖与磷酸的羟基之间形成的磷酸酯键。
不对称比率：不一致生物的碱基构成由很大的差异，这可用不对称比率（A+T）/（G+C）表示。
碱基互补规律：在形成双螺旋结构的过程中，由于各类碱基的大小与结构的不一致，使得碱基之间的互补配对只能在G…C（或者C…G）与A…T （或者T…A）之间进行，这种碱基配对的规律就称之碱基配对规律（互补规律）。
反密码子：在tRNA链上有三个特定的碱基，构成一个密码子，由这些反密码子按碱基配对原则识别mRNA链上的密码子。
反密码子与密码子的方向相反。
6顺反子（cistron）:基因功能的单位；一段染色体，它是一种多肽链的密码；一种结构基因。
核酸的变性、复性：当呈双螺旋结构的DNA溶液缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链DNA 便脱解为单链，这叫做核酸的“溶解”或者变性。
在适宜的温度下，分散开的两条DNA 链能够完全重新结合成与原先一样的双股螺旋。
这个DNA螺旋的重组过程称之“复性”。
增色效应：当DNA从双螺旋结构变为单链的无规则卷曲状态时，它在260nm处的汲取便增加，这叫“增色效应”。
减色效应：DNA在260nm处的光密度比在DNA分子中的各个碱基在260nm处汲取的光密度的总与小得多（约少35%~40%）, 这现象称之“减色效应”。
噬菌体（phage）：一种病毒，它可破坏细菌，并在其中繁殖。
也叫细菌的病毒。
发夹结构：RNA是单链线形分子，只有局部区域为双链结构。
这些结构是由于RNA单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成的，称之发夹结构。
DNA的熔解温度（T m值）：引起DNA发生“熔解”的温度变化范围只只是几度，这个温度变化范围的中点称之熔解温度（T m）。
分子杂交：不一致的DNA片段之间，DNA片段与RNA片段之间，假如彼此间的核苷酸排列顺序互补也能够复性，形成新的双螺旋结构。
淀粉酶米氏常数测定(1)
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75 0.25
2 1 3 0.75 0.25
3 1.5 2.5 0.75 0.25
4 2 2 0.75 0.25
5 2.5 1.5 0.75 0.25
6 3 1 0.75 0.25
蒸馏水(ml)
充分摇匀，60℃放置10min 加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀 取出1.0ml浓度梯度吸光度
不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水 0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入3.0ml的 0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于 5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于 660nm处测定吸光度（按操作表1操作）
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75
2 1 3 0.75
3 1.5 2.5 0.75
4 2 2 0.75
5 2.5 1.5 0.75
6 3 1 0.75
60℃放置，预热5min
酶液(ml)
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
充分摇匀，60℃放置10min 取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl 取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色 A660 可溶性淀粉量浓度% [s] 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢 二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸(C6H8O7·2O)8.07g， H 用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000 mI。 （6）0.2moL/L HCl 取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水 的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。
生物化学名词解释
1.米氏常数（Km）：是酶的一个特性常数，指当酶反应速率达到最大最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。
Km越小，酶的亲和力越大。
2. Chargaff定律：(1). 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T (2). 鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即G=C (3). 含氨基的碱基（腺嘌呤和胞嘧啶）总数等于含酮基的碱基（鸟嘌呤和胸腺嘧啶）总数，即A+C=T+G (4). 嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。
3.内吞：指被内吞物（称为配体，是蛋白质或者小分子）与细胞表面的专一性受体相结合，并随即引发细胞膜的内陷，形成的囊泡将配体裹入并输入到细胞内的过程。
4.呼吸链：又称电子传递链，电子在线粒体内膜从NADH传递到O2所经过的途径称为电子传递链，主要由NADH-Q 还原酶、琥珀酸-Q还原酶、细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶等组成的蛋白质复合体组成。
5.Bohr效应：具有氧传递能力的血红蛋白在水溶液或血液中时，如果CO2分压升高或pH降低，此时即使O2分压没有变化，O2饱和度也会减少，O2易从传递体上脱离，这种pH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为Bohr效应。
6.冈崎片段:DNA复制过程中，首先合成的是一些较短的DNA片段，长度约为1000个核苷酸左右，再由这些片段连接成完整的长链。
这些较短的DNA片段称为冈崎片段。
7.必需氨基酸：生物体正常生命活动所必需且自身不能合成，只能从外界摄取的氨基酸。
8.别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其他部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力）称为别构效应，可分为同促效应和异促效应。
9.Na+-K+ ATP酶：是一个跨脂膜的Na+-K+泵，即通过水解ATP提供的能量主动向外运输Na+，而向内运输K+。
乌本苷是Na+，K+—泵的专一性抑制剂。
10.新陈代谢：营养物质进入生物体内，转变为生物体自身的分子及生命活动所需的物质和能量等等的一切化学变化的总称为新陈代谢。
生物化学知识点
1.2．简述米氏常数Km的意义与特征。
2.Km为酶促反应速度为最大速度的一半时的底物浓度，米氏常数是酶的特征性物理常数，只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。
不同的酶Km值不同。
3.3．什么是酶的活性中心与必需基团？两者有什么关系？4.酶的活性中心：必需基团形成的与底物相结合并催化底物转化为产物的空间结构区域。
5.必需基团：氨基酸残基的侧链基团中，与酶活性密切相关的基团。
6.9．肌糖原和肝糖原的分解代谢有何异同？为什么？其生理意义有何区别？7.由于肌细胞中缺乏葡萄糖-6-磷酸化酶，而磷酸化的葡萄糖不能扩散到细胞外，故肝糖原分解成葡萄糖形成血糖；肌糖原生成的葡萄糖-6-磷酸主要在肌细胞中氧化功能。
肝糖原迅速形成血糖有利于维持血糖浓度的稳定，肌糖原有利于对肌组织快速供能。
8.10．丙酮酸脱氢酶系包括哪几种酶？哪几种辅助因子？9.丙酮酸脱氢酶系由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶组成；辅助因子有TPP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA。
10.12．何谓糖异生作用？那些代谢物在体内可转变为糖？糖异生作用的生理意义是什么？11.由非糖物质转变为葡萄糖和糖原的过程称为糖异生作用。
氨基酸、乳酸、丙酸、丙酮酸以及三羧酸循环中的各种羧酸和甘油等埔能异生为糖。
由非糖物质合成糖以保持血糖浓度的相对恒定；有利于乳酸的利用；可协助氨基酸代谢。
12.18.动物体内主要的呼吸链有哪些？简述NADH呼吸链的组成与排列顺序13.主要的呼吸链有NADH呼吸链、FAD呼吸链。
NADH呼吸链由复合物I（NADH-Q还原酶）、复合物II（琥珀酸-Q）复合物III（Q-细胞色素c 还原酶）复合物IV（细胞色素c氧化酶）14.21．试比较脂肪酸的生物合成与脂肪酸的β-氧化过程有有何异同？15.①两中反应进行的地点不同，合成反应在胞液中进行，β-氧化在线粒体中进行；②脂肪酸的高速合成需要柠檬酸，它是乙酰CoA羧化酶的激活剂，而β-氧化则不需要；③合成反应需CO2参与，而β-氧化不要；④加入和减去的糖单位不同，合成反应中是丙二酸单酰ACP分子；β-氧化中是乙酰CoA分子；⑤酰基载体不同，合成反应是ACPSH，β-氧化中是CoASH；⑥反应所需的辅酶不同，合成反应中，烯脂酰ACP的还原需要NADPH+H，而β-氧化中需FAD，β-酮脂酸的还原需NADPH+H，而β-氧化中需NAD+⑦所需要的酶不同，合成过程需要7种，β-氧化只要4种⑧能量需要或释放能量不同，合成过程消耗7ATP及14NADPH+H，β-氧化产生129ATP 16.去路：形成尿素；合成尿酸；合成谷氨酰胺；合成嘧啶嘌呤等含氮化合物；重新合成氨基酸；直接由肾脏生成NH4+排出。
基础生物化学试题（第三章-酶）单选题（含答案）
基础生物化学试题（第三章-酶）单选题（含答案）《基础生物化学》试题第三章酶单选题试卷总分：71答题时间：70分钟1.酶反应速度对底物浓度作图，当底物浓度达一定程度时，得到的是零级反应，对此最恰当的解释是：[1分]A形变底物与酶产生不可逆结合B酶与未形变底物形成复合物C酶的活性部位为底物所饱和D过多底物与酶发生不利于催化反应的结合参考答案：C2.米氏常数Km可以用来近似地度量[1分]A酶和底物亲和力大小的倒数B酶促反应速度大小C酶被底物饱和程度D酶的稳定性参考答案：A3.酶催化的反应与无催化剂的反应相比，在于酶能够[1分]A提高反应所需活化能B降低反应所需活化能C促使正向反应速度提高，但逆向反应速度不变或减小D可以改变反应平衡常数参考答案：B4.辅酶与酶的结合比辅基与酶的结合更为[1分] A紧B松C专一D相同参考答案：B5.下列关于辅基的叙述哪项是正确的？[1分] A是一种结合蛋白质B只决定酶的专一性，不参与化学基因的传递C与酶蛋白的结合比较疏松D一般不能用透析和超滤法与酶蛋白分开参考答案：D6.酶促反应中决定酶专一性的部分是[1分]A酶蛋白B底物C辅酶或辅基D催化基团参考答案：A7.下列关于酶的国际单位的论述哪一个是正确的?[1分]A一个IU单位是指在最适条件下，每分钟催化1mmoL底物转化所需的酶量B一个IU单位是指在最适条件下，每秒钟催化1mmoL产物生成所需的酶量C一个IU单位是指在最适条件下，每分钟催化1moL底物转化所需的酶量D一个IU单位是指在最适条件下，每秒钟催化1moL底物转化所需的酶量参考答案：A8.全酶是指什么？[1分]A酶的辅助因子以外的部分B酶的无活性前体C一种酶一抑制剂复合物D一种需要辅助因子的酶，具备了酶蛋白、辅助因子各种成分。
参考答案：D9.根据米氏方程，有关[s]与Km之间关系的说法不正确的是[1分]A当[s]< < Km时，V与[s]成正比；B当[s]＝Km时，V＝1/2VmaxC当[s] > >Km时，反应速度与底物浓度无关。
km生化名词解释
km生化名词解释
在生化领域中，KM可以指两种不同的物质：
1. 米氏常数（Km）：这是酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度。
它是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。
它被广泛应用到生物化学、分子生物学、基因工程、生物制药、临床用药等领域的理论、实验和实践中。
2. 一种生化试剂：KM是一种在生化中使用的合成试剂，称为肽，是一种长链氨基酸组成的肽键，它可以将多个氨基酸连接在一起形成一个蛋白质。
这种试剂可以模拟生物系统中发生的肽链化反应，有助于蛋白质合成和水解。
此外，它还可以促进一些特定的生物化学反应，如信号转导、细胞增殖和细胞凋亡。
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0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6பைடு நூலகம்
8
10
1/[S](1/m m ol.L )
实验器材
1、37℃恒温水浴 2、量筒 3、三角瓶 4、碱式滴定管（注意：排尽管内气泡） 5、试管
试剂
1．5% 酪蛋白溶液（pH8.5） 2．4%胰蛋白酶溶液 3．甲醛溶液 (自己稀释) 4．酚酞 5．0.1N NaOH（自己稀释）
注意事项
1、甲醛要稀释 2、酶促反应的时间要精确控制 3、滴定过程中要不断晃动锥形瓶 4、滴定终点的判断：30s内不褪色可视为稳 定。
操作
1、用配好的5%的酪蛋白原液配制7个浓度的酪蛋白 2、4%胰蛋白酶及酪蛋白37℃保温10min 3、取7个三角瓶，每个三角瓶加入甲醛5ml及酚酞10滴 4、酪蛋白试管1反应：加1ml胰蛋白酶混匀，反应5分 钟，将反应液转入三角瓶中，用0.1N的NaOH滴定， 直到获得稳定的粉红色为止。 试管2-7反应同上，计算NaOH量 5、以NaOH消耗的毫升数代表在每种底物浓度下的 V，以1/V对1/［S］作图，求出胰蛋白酶的米氏常数 Km和最大速度Vmax
生物化学实验
Biochemical Experiment 胰蛋白酶米氏常数 （Km）的测定 ——甲醛滴定法
目的要求
z掌握用滴定法测胰蛋白酶的米氏常数 z掌握双倒数作图法计算Km和Vmax
原理
z 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用双倒数 作图法测定Km值。 z 胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱 性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成 的肽键水解。水解时生成自由氨基。 z 常温下，甲醛能迅速与氨基酸上的氨基结合，形 成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，使溶液 的酸度增加，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，滴 定终点在酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此，可 用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
米氏方程
¾ 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中 间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推 导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关 系的著名公式，称为米氏方程。 ¾ Km：是酶的特征常数之一，只与酶的性质有 关，不同的酶其Km值不同。Km值表示酶与底物 之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶 的催化活性低。它等于酶促反应达到最大反应 速度一半时所对应的底物浓度。
V=
Vmax [S] Km + [S]
米氏方程
米氏方程中常数的意义
y=ax+b直线方程
¾ 米氏常数Km的测定：
测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的 作图法 — 双倒数作图法。
斜率=Km/Vmax
1.0
取米氏方程式的倒数形式：
1
0.8
Km
1
1
1/v
0.6
⎯⎯⎯ = ⎯⎯ × ⎯⎯⎯ + ⎯⎯ V Vmax [S] Vmax