《核酸类药物》PPT课件
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生物合成核酸类药物课件
酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸等8种
氨基酸也有促进作用。
除组氨酸外的其他8种氨基酸可以用高浓度的苯
丙氨酸一种来代替。
氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加。
第十六页，共34页幻灯片
发酵条件，如pH值、温度、通气搅拌等都是 影响肌苷积累的重要因素。
肌苷积累的最适pH值为6.0~6.2； 最适温度对枯草杆菌为30℃，对短小芽孢杆菌
（4）选育肌苷酸高产变异菌株，直接发酵 生产。
第二十六页，共34页幻灯片
一般采用方法（2）和方法（4）生产肌酸。
国外采用枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌的营养缺陷
型、抗代谢类似物、Mn2+不敏感抗生物素菌株， 以糖类等为基质的发酵法得到稳步发展，效 益显著。
工艺路线如下：
试管斜面培养→摇瓶种子培养→二级种子罐培 养→三级种子罐培养→发酵→板框压滤→脱色→ 活性炭吸附→浓缩结晶→精制
第二十七页，共34页幻灯片
4．肌苷酸的用途
肌苷酸可参与机体能量代谢以及蛋白质合成， 活化丙酮酸氧化酶，能使细胞在缺氧状态下 继续进行代谢。
肌苷酸的主要医用价值为白细胞或血小扳减少症、 各种急慢性肝炎、肺原性心脏病、中心性视网膜 炎、视神经萎缩症、放射线照射病、毛地黄中毒 症以及血吸虫病等的治疗。
由于腺嘌呤是肌苷酸的前体，而腺苷酸又是控制 IMP生物合成的主要因子，所以加入腺嘌呤的 多少，不仅影响菌体的生长，更影响肌苷积累。
腺嘌呤对肌苷积累最适浓度比菌体生长所需 要的最适浓度小一些，称为亚适量。
第十五页，共34页幻灯片
氨基酸促进肌苷积累、节约腺嘌呤用量。 其中组氨酸是必需的，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨
肌苷主要应用于心脏疾病、肝脏病、白细胞减 少症、放射性照射病、贫血病、血吸虫病、视 网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。
氨基酸也有促进作用。
除组氨酸外的其他8种氨基酸可以用高浓度的苯
丙氨酸一种来代替。
氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加。
第十六页，共34页幻灯片
发酵条件，如pH值、温度、通气搅拌等都是 影响肌苷积累的重要因素。
肌苷积累的最适pH值为6.0~6.2； 最适温度对枯草杆菌为30℃，对短小芽孢杆菌
（4）选育肌苷酸高产变异菌株，直接发酵 生产。
第二十六页，共34页幻灯片
一般采用方法（2）和方法（4）生产肌酸。
国外采用枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌的营养缺陷
型、抗代谢类似物、Mn2+不敏感抗生物素菌株， 以糖类等为基质的发酵法得到稳步发展，效 益显著。
工艺路线如下：
试管斜面培养→摇瓶种子培养→二级种子罐培 养→三级种子罐培养→发酵→板框压滤→脱色→ 活性炭吸附→浓缩结晶→精制
第二十七页，共34页幻灯片
4．肌苷酸的用途
肌苷酸可参与机体能量代谢以及蛋白质合成， 活化丙酮酸氧化酶，能使细胞在缺氧状态下 继续进行代谢。
肌苷酸的主要医用价值为白细胞或血小扳减少症、 各种急慢性肝炎、肺原性心脏病、中心性视网膜 炎、视神经萎缩症、放射线照射病、毛地黄中毒 症以及血吸虫病等的治疗。
由于腺嘌呤是肌苷酸的前体，而腺苷酸又是控制 IMP生物合成的主要因子，所以加入腺嘌呤的 多少，不仅影响菌体的生长，更影响肌苷积累。
腺嘌呤对肌苷积累最适浓度比菌体生长所需 要的最适浓度小一些，称为亚适量。
第十五页，共34页幻灯片
氨基酸促进肌苷积累、节约腺嘌呤用量。 其中组氨酸是必需的，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨
肌苷主要应用于心脏疾病、肝脏病、白细胞减 少症、放射性照射病、贫血病、血吸虫病、视 网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。
核酸与核苷类药物PPT课件
生产菌株： （1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP---肌 苷（肝炎辅助药）； （2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP---黄苷； （3）酶5缺失积累鸟苷。
• 发酵法生产肌苷
（1）肌苷生产工艺 （2）发酵工艺条件： ▪ 碳源为葡萄糖 ▪ 保证充足的氮源 ▪ 磷酸盐的影响 ▪ Mg+、Ca+有促进作用 ▪ 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 ▪ 最适发酵温度为30--34℃，pH6.0—6.2 ▪ 需大风量,高溶氧和低CO2
发酵法生产核苷酸
1、发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加
2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或 鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。
产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸 发酵机制:
积累IMP的主要前提：
（1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量
碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生 成2′，3 ＇ -环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易 加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5% 的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保 温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解 成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核 苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异 性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的 升白血球均有较好疗效。
后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的 重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临 床药物。
正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑 核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。
核酸类药物PPT课件
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二、核苷及其衍生物 依据形成核苷的碱基或核糖的不同分为： 腺苷类：有腺苷、肌浸膏、核脉通、腺苷甲硫氨酸
(SAM)、辅酶型维生素B12(Co-B12)、腺苷二醛、巯 苷、嘌呤霉素(Puromycin) 尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、 溴苷 胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂 胞苷(Azacyti-dine) 肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex) 脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、 脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
德国生化学家科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了 核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一 些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝 尔医学与生理学奖。
在Tm时，表现出260nm的光吸收值急剧上升的增 色效应、比旋度值显著降低和黏度下降等现象。 通常DNA的Tm是增色效应达40％～50％时的温度， RNA的Tm为增色效应达30％～40％时的温度。
Tm大小与DNA的碱基组成有关。G-C之间的氢键 联系要比A-T之间的氢键联系强得多，故G-C含量 高的DNA其Tm值亦高。
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等球批准上市的第一个反义药物，1998 年已被美国FDA批准上市，用于二线治疗AIDS所致 的巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。
二、核苷及其衍生物 依据形成核苷的碱基或核糖的不同分为： 腺苷类：有腺苷、肌浸膏、核脉通、腺苷甲硫氨酸
(SAM)、辅酶型维生素B12(Co-B12)、腺苷二醛、巯 苷、嘌呤霉素(Puromycin) 尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、 溴苷 胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂 胞苷(Azacyti-dine) 肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex) 脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、 脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
德国生化学家科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了 核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一 些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝 尔医学与生理学奖。
在Tm时，表现出260nm的光吸收值急剧上升的增 色效应、比旋度值显著降低和黏度下降等现象。 通常DNA的Tm是增色效应达40％～50％时的温度， RNA的Tm为增色效应达30％～40％时的温度。
Tm大小与DNA的碱基组成有关。G-C之间的氢键 联系要比A-T之间的氢键联系强得多，故G-C含量 高的DNA其Tm值亦高。
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等球批准上市的第一个反义药物，1998 年已被美国FDA批准上市，用于二线治疗AIDS所致 的巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。
核酸类药物ppt课件
主要用于病毒性角膜炎、单纯疱疹、慢性病
毒性肝炎的辅助治疗。
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适用于绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、急性淋巴细 胞白血病及急性非淋巴细胞白血病、慢性粒细胞 白血病的急变期。
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【不良反应】 ①骨髓抑制：较常见； ②肝脏损害：可致胆汁郁积出现黄疸； ③消化系统：恶心、呕吐、食欲减退、腹
泻和口腔炎，但较少发生； ④高尿酸血症：多见于白血病治疗初期，
严重的可发生尿酸性肾病。
核酸药物中另一类为裸DNA基因疫苗 与基因药物，它们是将具有预防和治 疗疾病的功能基因与真核表达载体重 组，将此重组DNA导入人体细胞，使 其表达活性的多肽或蛋白质，产生免 疫或治疗作用。
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第二节 核酸类药物各论
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一、碱基及其衍生物 巯嘌呤（6-巯基嘌呤）
【作用与用途】
属于抑制嘌呤合成的细胞周期特异性药物，化学 结构与次黄嘌呤相似，能竞争性地抑制次黄嘌呤 的转变过程，在抗肿瘤方面拥有较大市场。
（一）碱基及其衍生物
多数是经过人工化学修饰的碱基衍生 物，主要有巯嘌呤、氟尿嘧啶等。
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（二）核苷及其衍生物
1.腺苷类:阿糖腺苷等。 2.尿苷类:碘苷等。 3.胞苷类:阿糖胞苷等。 4.肌苷类:肌苷等。 5.脱氧核苷类:氮杂脱氧胞苷等。
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（三）核苷酸及其衍生物
1.单核苷酸类:有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷酸 (IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双腺苷酸、辅酶A等。
第十一章 核酸类药物-1第一节 核 Nhomakorabea类药物概述
核酸由核苷酸组成； 核苷酸由碱基、戊糖和磷酸三部分
组成； 戊糖与碱基组成的单元叫核苷。
核酸类药物ppt精选课件
肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex) 脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、
脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质， 有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受 损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白 细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核 苷酸、CTP、UTP、腺苷、混合核苷酸、辅酶I等。
.
第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚 合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿 瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫 抑制的临床药物。
已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一 些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞 嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、 环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺 苷酸、聚肌胞等。
.
反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
第五章 核酸类药物
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1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质， 有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受 损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白 细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核 苷酸、CTP、UTP、腺苷、混合核苷酸、辅酶I等。
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第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚 合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿 瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫 抑制的临床药物。
已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一 些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞 嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、 环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺 苷酸、聚肌胞等。
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反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
第五章 核酸类药物
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1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
《核酸与核苷类药物》PPT课件
• 核酸类物质药物一般可分为两大类： • 一类具天然结构的核酸类物质， • 另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。
前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生 物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改 善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促 使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射 病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管 疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、 CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶Ⅱ等，多数是生物体 自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小， 基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内 释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解 RNA，90 ℃保持3－4h破坏酶)。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%－8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通 透性，使核酸从细胞内释放出来。
RNA提取实例：
[提取]
[中和] HCl
[酸化、沉淀]HCl
酵母
提取液
上清液
RNA
NaOH、水
pH 7、离心
pH
2.5、离心
二、DNA的提取与制备
工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀， 倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离 心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直 接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐 加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温 干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
核酸类药物课件
例二: 鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度 控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反 应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。
三、核苷的制备 本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 （－）RNA化学水解法制备核苷 1. 核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
（－）RNA化学水解法制备核苷 1. 核苷生产工艺流程（图14·8）
（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点:
①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株；
②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌；
4．菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程:
5. 碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗 和放疗后的升白血球均有较好疗效。
（二）生产工艺 1．以5＇－CMP为原料的合成法 （1）工艺路线:
2.工艺过程：
三、核苷的制备 本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 （－）RNA化学水解法制备核苷 1. 核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
（－）RNA化学水解法制备核苷 1. 核苷生产工艺流程（图14·8）
（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点:
①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株；
②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌；
4．菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程:
5. 碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗 和放疗后的升白血球均有较好疗效。
（二）生产工艺 1．以5＇－CMP为原料的合成法 （1）工艺路线:
2.工艺过程：
核酸类药物分析ppt课件
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核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、 核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。 按照化学结构和组成可分成四类： ①核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等； ②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林、阿糖胞苷； ③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷 腺苷； ④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗肿 瘤免疫核糖核酸等。
《中国药典》从２００５年版开始改用阳离子交换色 谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。
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利巴韦林的含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 用磺化交联的苯乙烯－
二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用 稀硫酸调节ｐＨ值至２.５±０.１） 为流动相；检测 波长为２０７ｎｍ。理论板数按利巴韦林峰计算不低于２０ ００。 离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入 适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解 度。
（２）二苯胺反应 脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产
生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物， 在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。
蓝色 595nm
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２磷酸盐的鉴别 核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解产生的磷酸与过量
的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼酸铵放冷析 出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。
收波长的吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的ＨＰ ＬＣ法定量。
核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外 分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能 力的高效液相色谱法。
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（一）非水碱量法 １原理
核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱，在水溶 液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。 而在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加， 可被高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积 即可计算该类药物的含量。
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核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、 核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。 按照化学结构和组成可分成四类： ①核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等； ②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林、阿糖胞苷； ③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷 腺苷； ④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗肿 瘤免疫核糖核酸等。
《中国药典》从２００５年版开始改用阳离子交换色 谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。
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利巴韦林的含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 用磺化交联的苯乙烯－
二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用 稀硫酸调节ｐＨ值至２.５±０.１） 为流动相；检测 波长为２０７ｎｍ。理论板数按利巴韦林峰计算不低于２０ ００。 离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入 适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解 度。
（２）二苯胺反应 脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产
生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物， 在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。
蓝色 595nm
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２磷酸盐的鉴别 核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解产生的磷酸与过量
的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼酸铵放冷析 出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。
收波长的吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的ＨＰ ＬＣ法定量。
核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外 分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能 力的高效液相色谱法。
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（一）非水碱量法 １原理
核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱，在水溶 液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。 而在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加， 可被高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积 即可计算该类药物的含量。
核酸类药物分析课件
核酸类药物分析
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（二）紫外分光光度法
嘌呤碱基和嘧啶碱基的紫外吸收特征除了可用 于鉴别外，还可用于该类药物的含量测定。
《中国药典》（２０１５年版） 收载的巯嘌呤、 氟尿嘧啶和别嘌醇的原料药均采用紫外分光光度法中 的吸收系数法进行含量测定。
（三）高效液相色谱法
大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色 谱法进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核 酸类药物采用常规方法分离时，效果较差，需改用一 些特殊的高效液相色谱法，如离子对色谱法或离子交 换色谱法。
多核苷酸、核苷酸、核苷类药物中均含有戊糖； 多核苷酸和核苷酸结构中都含有磷酸。 因此它们有一些共同的分析方法，如用紫外分光光度法进 行鉴别或含量测定。
核酸类药物分析
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一、鉴别
（一）化学鉴别
１戊糖的鉴别
（１）地衣酚反应
核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷与酸共热时，水
解形成的戊糖基脱水变为糠醛，再与绿３色，67５0nm二
离子对色谱法是在流动相中加入适量的反离子，使其 与呈解离状态的待测组分形成离子对，增加其在非极性固 定相上的分配，从而改善其色谱保留与分离行为。
核苷酸为酸性物质，故其离子对试剂常用季铵盐阳离 子试剂，如四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵。离子对色谱 的影响因素较多，包括反离子的性质和浓度、流动相的组 成、ｐＨ值和离子强度等，需仔细选择。
核酸类药物分析
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（３）巯嘌呤分子上的巯基（—ＳＨ）与氨试液反应，生成 铵盐，溶解度增大，溶液变澄清，再与硝酸银试液反应，生 成溶解度较小的巯嘌呤银白色絮状沉淀，在热硝酸中不溶。
（４）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
核酸类药物分析
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（二）检查
１. ６－羟基嘌呤
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浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释 放出来。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
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脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
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（二）发酵法生产核苷酸 1．发酵法生产肌苷酸（IMP） 2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸
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（三）半合成法制备核苷酸
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。
（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很 好 的 资 源 。 取 100g 压 榨 啤 酒 酵 母 （ 含 水 份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）。
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
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5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取 RNA 配 成 3 ％ ～ 3.5% 的 水 溶 液 ， 加 氢 氧 化 钠 达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。
通 常 在 细 菌 中 RNA 占 5 ％ ～ 25 ％ ， 在 酵 母 中 占 2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
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在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～
3℃操作）。
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二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
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2、酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
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2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经
组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，
沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，
将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分
钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基
磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在
例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度 控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L， 反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。
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（二）DNA的提取与制备
1．工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生 产 脱 氧 核 苷 酸 。 如 要 制 成 固 体 状 DNA ， 在 热 变 性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
第十二章 核酸类药物
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第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产
一、RNA与DNA的提取与制备
（一）RNA的提取与制备
1、工业用RNA的提取
（1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。
上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤
维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得
粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二
烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm
离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加
入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空
（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。
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稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA 沉 淀 出 来 。 上 法 的 缺 点 是 制 得 的 RNA Mr 较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
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3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
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4．菌体自溶法生产核苷酸
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
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脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
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（二）发酵法生产核苷酸 1．发酵法生产肌苷酸（IMP） 2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸
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（三）半合成法制备核苷酸
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。
（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很 好 的 资 源 。 取 100g 压 榨 啤 酒 酵 母 （ 含 水 份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）。
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
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5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取 RNA 配 成 3 ％ ～ 3.5% 的 水 溶 液 ， 加 氢 氧 化 钠 达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。
通 常 在 细 菌 中 RNA 占 5 ％ ～ 25 ％ ， 在 酵 母 中 占 2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
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在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～
3℃操作）。
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二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
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2、酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
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2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经
组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，
沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，
将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分
钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基
磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在
例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度 控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L， 反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。
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（二）DNA的提取与制备
1．工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生 产 脱 氧 核 苷 酸 。 如 要 制 成 固 体 状 DNA ， 在 热 变 性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
第十二章 核酸类药物
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第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产
一、RNA与DNA的提取与制备
（一）RNA的提取与制备
1、工业用RNA的提取
（1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。
上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤
维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得
粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二
烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm
离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加
入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空
（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。
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稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA 沉 淀 出 来 。 上 法 的 缺 点 是 制 得 的 RNA Mr 较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
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3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
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4．菌体自溶法生产核苷酸