各种生化指标测定方法

2.3 各项指标的测定方法

2.3.1 生物学指标的测定

于芥蓝菜薹采收期，每处理随机抽取6株，测定芥蓝生物学性状指标，包括株高，薹粗，节数，单株产量和叶面积。

2.3.1.1 株高测定

菜薹长度为第一片真叶基部至生长点的距离，取平均值。

2.3.1.2 薹粗测定

用游标卡尺测量第5与第6片叶之间的粗度，取平均值。

2.3.1.3节数和节间长度测定

节数为第一片真叶基部起至生长点的节数，节间长度=株高/节数

2.3.1.4 单株产量测定

取第4节位以上植株进行测定，求单株鲜重。

2.3.1.5 蜡粉含量的测定

参照Kumar.S方法测定（Kumar S，1987）。将芥蓝叶片剪成条状，称取1.0g，放于培养皿中，用10ml氯仿浸泡30秒，取出叶片立即烘干。将培养皿在室温下蒸发干燥，蜡粉含量为培养皿增重（mg/g）。重复三次。

2.3.2 光和系统指标的测定

2.3.2.1 叶面积的测定

取第5片及以上共6片叶进行测定，求单株总叶面积。采用Li-COR 公司生产的Li-3000A 型叶面积仪测量叶面积。用直尺测量芥蓝叶片的长度（L，叶柄基部到叶尖的距离）和宽度（W，与主脉垂直的最大宽度），用Li- COR公司的Li- 3000A型叶面积仪测量实际叶面积（LA）。用回归的方法建立实际叶面积与芥蓝叶片长乘以宽面积之间的回归方程，找出最佳回归系数。

2.3.2.2 比叶重测定

于各处理中随机取10片叶子，用0.8mm打孔器，在叶片最宽处离主脉两侧的中心位置打孔，将10个小圆片放在烘样盒后在105℃杀青10min，再80℃烘至恒重。

比叶重=总叶干重/总叶面积(g/m2)

2.3.2.3 叶绿素含量测定

采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管，用95%的乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，至叶片表皮变白，取上清夜在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。

计算公式：

叶绿素a（mg/L）=13.95A665－6.88A649 （1）

叶绿素b（mg/L）=24.96 A649－7.32A665 （2）

类胡萝卜素（mg/L）=（1000A470-2.05C a－114.8C b）/245

(1)、(2)相加即得叶绿素总浓度，在按照下式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。色素含量（mg/g）=（色素浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重

2.3.2.4 光和特性测定

使用美国LI-COR公司生产的LI-6400型便携式自动光合作用测定仪测定光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度和气孔导度，测定时间为早上9:00～11:00。2.3.3 根系指标的测定

2.3.3.1 根体积测定

用排水法测根系体积。

2.3.3.2 根系直径测定

采用WinRHIZO根系分析系统对芥蓝根系进行扫描。

2.3.3.3 根系活力测定

参照李合生（2000）的方法，略有改进。于菜薹采收期，称取根尖样品0.5g，放人10mL烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1-3h，此后加入1mol/L硫酸2mL，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。然后把根取出，吸干水分后，用4 mL乙酸乙酯和少量石英砂研磨以提取甲腙。红色提取液移入试管，并用3mL乙酸乙酯把残渣洗涤两次，移入试管，乙酸乙酯体积共计10 mL 。用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验做参比测出吸光度值，查标准曲线，即可求出TTC 还原量。

单位根鲜重的四氮唑还原强度=四氮唑还原量/(根重×时间) mg/(g﹒h)

2.3.4 氮物质含量及代谢酶活力的测定

2.3.4.1硝酸盐含量的测定

参照李合生（2000）方法，取0.5g剪碎的样品放入刻度管中，加入6mL去离子水，盖上塞子，放入沸水浴中30 min后取出，用自来水冷却，将提取液过滤到100mL容量瓶中，反复冲洗残渣，最后定容至刻度。吸取样品液0.1mL，然后加入5％水杨酸-硫酸溶液0.4 mL，混匀后室温下静置30min，再慢慢加入9.5mL 8％氢氧化钠溶液，待冷却至室温后，在波长410nm处测定其吸光度，再根据标准曲线查得硝酸盐的含量。结果按下式计算：

单位鲜重样品中硝态氮含量（mg/g）=(C×V1)/(W×V2)

C：回归方程中硝态氮浓度，ug/ mL；

W：样品鲜重，g；

V1：样品定容体积，mL；

V2：测定用提取液体积，mL。

2.3.4.2硝酸还原酶活性的测定

采用离体法（李合生，2000），称取0.5g剪碎的鲜样，置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中用4mL提取缓冲液研磨成匀浆，转移至离心管中在4°C、4000rpm 下离心15 min，取上清液0.4mL于10mL试管中，加入1.2毫升0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL2mg/mL NADH溶液，混匀，在25°C水浴中保温30min，然后加入1mL磺胺溶液中止反应，再加1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000rpm下离心5min，取上清液在540nm波长下比色测定吸光度，根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量。

单位样品中硝酸还原酶活性=（x×V1）/( V2×W× t)

X：回归后亚硝态氮的含量，ug；

V1；提取酶时加入的缓冲液体积，mL；

V2；酶反应时加入的粗酶液体积，mL；

W：样品鲜重，g；

t：反应时间，h。

2.3.4.4游离氨基酸含量的测定

采用（李合生，2000），称取新鲜样品，洗净、剪碎、混匀后，迅速称取0.5g于研钵中，加入5mL10％乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100mL，混