各种生化指标测定方法

2.3 各项指标的测定方法2.3.1 生物学指标的测定于芥蓝菜薹采收期，每处理随机抽取6株，测定芥蓝生物学性状指标，包括株高，薹粗，节数，单株产量和叶面积。

2.3.1.1 株高测定菜薹长度为第一片真叶基部至生长点的距离，取平均值。

2.3.1.2 薹粗测定用游标卡尺测量第5与第6片叶之间的粗度，取平均值。

2.3.1.3节数和节间长度测定节数为第一片真叶基部起至生长点的节数，节间长度=株高/节数2.3.1.4 单株产量测定取第4节位以上植株进行测定，求单株鲜重。

2.3.1.5 蜡粉含量的测定参照Kumar.S方法测定（Kumar S，1987）。

将芥蓝叶片剪成条状，称取1.0g，放于培养皿中，用10ml氯仿浸泡30秒，取出叶片立即烘干。

将培养皿在室温下蒸发干燥，蜡粉含量为培养皿增重（mg/g）。

重复三次。

2.3.2 光和系统指标的测定2.3.2.1 叶面积的测定取第5片及以上共6片叶进行测定，求单株总叶面积。

采用Li-COR 公司生产的Li-3000A 型叶面积仪测量叶面积。

用直尺测量芥蓝叶片的长度（L，叶柄基部到叶尖的距离）和宽度（W，与主脉垂直的最大宽度），用Li- COR公司的Li- 3000A型叶面积仪测量实际叶面积（LA）。

用回归的方法建立实际叶面积与芥蓝叶片长乘以宽面积之间的回归方程，找出最佳回归系数。

2.3.2.2 比叶重测定于各处理中随机取10片叶子，用0.8mm打孔器，在叶片最宽处离主脉两侧的中心位置打孔，将10个小圆片放在烘样盒后在105℃杀青10min，再80℃烘至恒重。

比叶重=总叶干重/总叶面积(g/m2)2.3.2.3 叶绿素含量测定采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管，用95%的乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，至叶片表皮变白，取上清夜在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。

计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95A665－6.88A649 （1）叶绿素b（mg/L）=24.96 A649－7.32A665 （2）类胡萝卜素（mg/L）=（1000A470-2.05C a－114.8C b）/245(1)、(2)相加即得叶绿素总浓度，在按照下式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。

色素含量（mg/g）=（色素浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重2.3.2.4 光和特性测定使用美国LI-COR公司生产的LI-6400型便携式自动光合作用测定仪测定光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度和气孔导度，测定时间为早上9:00～11:00。

2.3.3 根系指标的测定2.3.3.1 根体积测定用排水法测根系体积。

2.3.3.2 根系直径测定采用WinRHIZO根系分析系统对芥蓝根系进行扫描。

2.3.3.3 根系活力测定参照李合生（2000）的方法，略有改进。

于菜薹采收期，称取根尖样品0.5g，放人10mL烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1-3h，此后加入1mol/L硫酸2mL，以停止反应。

（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。

然后把根取出，吸干水分后，用4 mL乙酸乙酯和少量石英砂研磨以提取甲腙。

红色提取液移入试管，并用3mL乙酸乙酯把残渣洗涤两次，移入试管，乙酸乙酯体积共计10 mL 。

用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验做参比测出吸光度值，查标准曲线，即可求出TTC 还原量。

单位根鲜重的四氮唑还原强度=四氮唑还原量/(根重×时间) mg/(g﹒h)2.3.4 氮物质含量及代谢酶活力的测定2.3.4.1硝酸盐含量的测定参照李合生（2000）方法，取0.5g剪碎的样品放入刻度管中，加入6mL去离子水，盖上塞子，放入沸水浴中30 min后取出，用自来水冷却，将提取液过滤到100mL容量瓶中，反复冲洗残渣，最后定容至刻度。

吸取样品液0.1mL，然后加入5％水杨酸-硫酸溶液0.4 mL，混匀后室温下静置30min，再慢慢加入9.5mL 8％氢氧化钠溶液，待冷却至室温后，在波长410nm处测定其吸光度，再根据标准曲线查得硝酸盐的含量。

结果按下式计算：单位鲜重样品中硝态氮含量（mg/g）=(C×V1)/(W×V2)C：回归方程中硝态氮浓度，ug/ mL；W：样品鲜重，g；V1：样品定容体积，mL；V2：测定用提取液体积，mL。

2.3.4.2硝酸还原酶活性的测定采用离体法（李合生，2000），称取0.5g剪碎的鲜样，置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中用4mL提取缓冲液研磨成匀浆，转移至离心管中在4°C、4000rpm 下离心15 min，取上清液0.4mL于10mL试管中，加入1.2毫升0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL2mg/mL NADH溶液，混匀，在25°C水浴中保温30min，然后加入1mL磺胺溶液中止反应，再加1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000rpm下离心5min，取上清液在540nm波长下比色测定吸光度，根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量。

单位样品中硝酸还原酶活性=（x×V1）/( V2×W× t)X：回归后亚硝态氮的含量，ug；V1；提取酶时加入的缓冲液体积，mL；V2；酶反应时加入的粗酶液体积，mL；W：样品鲜重，g；t：反应时间，h。

2.3.4.4游离氨基酸含量的测定采用（李合生，2000），称取新鲜样品，洗净、剪碎、混匀后，迅速称取0.5g于研钵中，加入5mL10％乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100mL，混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。

吸取样品滤液1.0mL，放入20 mL干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0mL，再加水合茚三酮3.0mL，抗坏血酸0.1mL，摇匀，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红的被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60％乙醇定容至20mL，混匀后用1cm比色皿在570nm波长下测吸光度。

氨基态氮（ug/g）=C×V1/(W×V2)C:标准曲线查得的氨基态氮含量，ug；V1：稀释总体积，mL；V2：比色用体积，mL；W：样品中，g。

2.3.4.5可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法（李合生，2000），称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水研磨成匀浆后，10000rpm下离心10min，取上清液0.2mL，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀，放置2min后在波长595nm处测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质的含量。

样品中蛋白质的含量(mg/g)= C×V1/(W×V2×1000)C：查标曲得到的蛋白含量，ug；V1：总提取液体积，mL；V2：测定时加样量，mL；W：样品鲜重，g。

2.3.5 抗氧化系统的测定2.3.5.1 膜透性的测定参照李锦树等（1986）的方法，用直径10mm的打孔器从芥蓝叶片组织上打取10个圆片，蒸馏水清洗三次后用滤纸吸干，放入50mL具塞刻度试管中，加入20mL蒸馏水，静置30min，用DDS-307型电导仪测定其电导率，煮沸30min 后，冷却至室温，再测定其电导率，以相对电导率表示细胞膜透性。

相对电导率=（初电导率/终电导率）×100%2.3.5.2维生素C含量的测定参照比色法（李合生，2000），称取鲜样2g，用3mL2％草酸研磨至匀浆，转入100mL容量瓶，残渣用1％草酸冲洗，然后加入1mL30％硫酸锌，摇匀，再加入1mL15％亚铁氰化钾，用1％草酸定容至刻度。

过滤，取4mL于具塞大试管中，依次加入染料2mL，二甲苯5mL，用快速混匀器（SK96-A）萃取约20秒，静置后二甲苯与水分层，取上层液，在波长500nm处测定其吸光度，并通过标准曲线查得维生素C的含量。

Vc含量（mg/g）=X×V1/(W×V2)X：4 mL提取液中含有Vc的量，mg；V1：提取液总体积，mL；V2：测定用体积，mL；W：样品鲜重。

2.3.5.3 脯氨酸含量的测定用茚三酮显色法测定（李和生，2000）：称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5 mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程要经常摇动），冷却后过滤至干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

吸取2 mL提取液于另一干净的试管中，加入2mL冰醋酸及2 mL 酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液呈红色。

冷却后加入4 mL甲苯，用快速混匀器（SK96-A）萃取约20秒，静置后取上层液至10mL离心管中，在3000 r/min下离心5min。

吸取上层红色甲苯液比色，以甲苯为空白对照，测520nm 处吸光值。

脯氨酸含量（ug/g）=5×X/（2×W）X：标曲查得的脯氨酸含量，ug；W：样品鲜重，g。

2.3.5.4 丙二醛（MDA）含量的测定参照李合生等（2000）的方法。

取植物鲜样0.5g，加5%三氯乙酸5 mL研磨，之后匀浆在3000r/min下离心10min。

取上清液2 mL ，加0.67%硫代巴比妥酸2 mL ，混合后在100℃水浴中保温30分钟，立即置于冰浴中冷却，之后在1500rpm下再离心10分钟，取上清液测定波长450nm、530nm和600nm处的吸光度。

计算公式：MDA含量（umol·L－1）=6.45(A532-A600)-0.56A4502.3.5.5过氧化物酶（POD）活性的测定参照林植芳（1988）的方法。

取1g样品，加入0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.15 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0），用液氮磨碎，提取液于4℃下15,000 rpm 离心20min，上清液用于酶活性的测定。

3 mL反应体系中含有0.2%愈创木酚0.9 mL，0.1%的过氧化氢（H2O2）2.0 mL和0.1酶液。

加入酶液后，测定OD470值的变化，以每分钟△OD470变化0.01表示一个酶活性单位。

POD总活性(μ·g-1·min-1)=△A×V1/（V2×W×T×0.001）△A ：每分钟吸光度值的变化；V1：提取酶液总体积，mL；V2：测定用酶液体积，mL；W：样品鲜重。

T：反应时间，min。

2.3.5.6过氧化氢酶（CAT）活性测定参照Chance等（1995）的方法，略加改进。

样品提取同POD方法。

3毫升反应体系含有1mL 0.2%过氧化氢、1.9mL双蒸水。