稳定转染步骤
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理:细胞转染主要通过三种方法实现:物理法、化学法和生物学法。
1.物理法:通过高压、电穿孔、微射流等方式,使细胞膜发生瞬时破裂,从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法:通过化学物质,如聚吡咯、脂质体等,使外源分子与细胞膜结合,从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺(PEI)法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法:通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞,实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒(AAV)转染、逆转录病毒(RETRO)转染等。
二、细胞转染的操作步骤:1.细胞的预处理:根据细胞类型和实验要求,将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期,但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞,如悬浮细胞,可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备:将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA,或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择:根据实验要求选择合适的转染方法,如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下,物理法适用于悬浮细胞,化学法适用于贴壁细胞,而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作:a.物理法:i.电穿孔法:将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中,然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法:使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法:i.PEI法:将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合,在适当条件下形成复合物,然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法:将外源DNA与磷酸钙按比例混合,并静置形成磷酸钙- DNA沉淀,然后加入至目标细胞中。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸(DNA)或核苷酸序列引入细胞内的技术。
这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。
在细胞转染过程中,有几个重要步骤需要注意。
下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。
第1步:提取DNA或RNA在细胞转染前,需要先准备好DNA或RNA。
其中,DNA可通过PCR扩增、酵母合成,或从细胞中提取。
RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)反转录,然后进行DNA扩增。
第2步:选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法,包括电穿孔、热休克、化学转染等。
要选择适合的转染方法,需要考虑许多因素,如细胞类型、转染效率和毒性等。
常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。
第3步:制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液,用于将DNA或RNA引入细胞。
制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合,然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒,最终形成复合物。
转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中,让细胞与其接触。
接触后,DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。
转染过程通常需要一定程度的时间,具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。
第5步:培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。
这通常需要注意以下几个因素:1)细胞浸润度:细胞密度应该适合,以便观察细胞形态和产物的表达量。
2)培养基成分:为了保持细胞生长,需要选择适当的培养基成分。
3)药物筛选:转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选,以便筛选出目标基因。
4)稳定性维护:为了保证目标基因稳定的表达,需要适当地维护和稳定细胞系。
以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。
在进行细胞转染时,需要注意步骤的顺序和方法的选择,以便提高转染效率和成功率。
稳转流程
做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1,由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2,G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3,汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到 1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3×106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1 /300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
EndoFectin-CHO 转染试剂 说明书
EndoFectin™-CHO 转染试剂■ 产品概述:EndoFectin™ CHO 转染试剂是一种具有专利的阳离子聚合物试剂,它能与核酸形成复合物,并使该复合物进入哺乳动物细胞。
EndoFectin™ CHO 转染试剂专为转染CHO 细胞,并构建稳定的细胞系而设计。
即使在有血清存在的情况下,它仍然能高效的将核酸导入细胞。
GeneCopoeia 公司提供的 EndoFectin™ CHO 转染试剂有如下优点:• 优越的转染效率• 重组蛋白的高表达水平• 与含血清的培养基相兼容• 低细胞毒性• 易于操作■ 成分及储存条件:• 每管含有经过滤除菌的EndoFectin™ CHO 转染试剂• EndoFectin™ CHO 转染试剂 可于常温下运输。
4-8℃密闭保存。
该试剂在4-8℃的条件下,可保持稳定至少12个月。
■ 质量控制:每批EndoFectin™ CHO 均经过转染测试。
我们将eGFP 表达质粒(GeneCopoeia Catalog No. EX-EGFP-Lv01)用EndoFectin™ CHO 转染试剂转入subconfluent HEK-293 细胞。
转染16小时后,超过95%的细胞表达eGFP 。
■ 实验开始前的注意事项:质粒的质量:请务必使用高质量转染级无内毒素的质粒。
通过260nm 光吸收测定DNA 浓度,260nm/280nm 比值确定DNA 纯度(比值应该在1.8~2.0的范围之内)。
如有可能,请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
细胞的条件:使用适当保存和经常传代的健康细胞。
确保培养基没有被细菌,真菌或支原体污染。
如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞,请在转染前至少传代两次。
■ 瞬时转染方法:1. 接种细胞1转染前一天,用胰酶消化细胞并计数。
调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,总体积如表1所示。
每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。
2. 准备DNA/EndoFectin™复合物GeneCopoeia Inc.19520 Amaranth DriveGermantown, Maryland 20874USATel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: GeneCopoeiaTMExpressway to Discovery用于转染核酸到哺乳动物细胞产品套装编号: Z0103储存条件:4℃-8℃保存 产品编号Z01030A Z01030BZ01030C (A*5)包装规格1mL 0.5mL 5 mL地址:广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D 区8楼,510663客服电话*************电子信箱:********************网址:该产品仅限于实验科学研究用,若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断、治疗等其他国家专门规定的特殊用途,本公司概不承担任何责任。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术,以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。
LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂,广泛应用于多种细胞系中。
以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。
一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代:将细胞进行传代,以保证其在良好的状态下进行实验。
1.2细胞密度调整:将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度,以保证细胞的适宜转染。
1.3细胞处理准备:在转染前,将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中,以保持细胞的完整性和适宜的状态。
二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备:将外源DNA或RNA在无菌条件下制备,并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。
2.2转染试剂配制:将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水,稀释成适宜浓度的转染试剂。
三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合:将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中,轻轻混合均匀。
注意,避免过量试剂和核酸的使用,以减少细胞的毒性和副作用。
3.2孵育混合物:将混合物在常温条件下孵育15-30分钟,以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。
四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合:将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上,缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。
4.2转染时间及培养条件:将细胞放置在转染液中,保持静止状态,同时将培养皿放回培养箱中,在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。
转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化,一般为4-6小时。
4.3转染液的去除:将转染液小心去除,并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次,以去除残留的转染试剂。
五、细胞处理及分析5.1细胞培养:将细胞放回恒温恒湿培养箱中,用适宜培养基进行细胞的培养。
转染步骤范文
转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程,用于基因工程、基因治疗等研究和应用。
转染步骤是实现转染的关键步骤,包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
以下是转染步骤的详细描述。
第一步:细胞培养在进行转染实验之前,首先需要培养并扩增所使用的细胞。
细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等,培养基中会添加适当的酵素抑制剂(如胰酶)和生长因子,以促进细胞的生长和增殖。
第二步:转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂,也可以是病毒载体或质粒DNA。
化学试剂常见的有聚乙烯亚胺(PEI)、脂质体、阳离子聚合物等。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。
质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。
第三步:转染试剂处理在这一步中,将转染试剂与细胞一起孵育,以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。
转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定,常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。
第四步:细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后,可以对转染效率进行分析。
常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。
通过这些分析方法,可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞,并根据实验需要进行下一步操作。
除了以上步骤,还有一些实验时需要注意的要点,例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。
同时,也需要仔细阅读相关实验操作手册,并参考先前类似研究的文献,以确保实验的准确性和可重复性。
总结起来,转染步骤是进行基因转染的重要环节,包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
通过精确执行每个步骤,并结合适当的方法和实验操作要点,可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中,实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。
[说明]转染详细步骤大攻略
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提,测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板,待细胞密度长到90%左右时,按lipo2000说明书转染A549细胞,36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提,具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物,12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和,以免污染基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊,冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min,不时振荡,溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含质粒DNA,下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管,弃下层油状相,注意不要吸入油状相,重复抽提三次,即重复步骤5-7三次。
干细胞稳定转染的步骤
干细胞稳定转染的步骤1.选择合适的载体:选择适合干细胞转染的载体,常用的有携带选择标记基因的质粒载体或病毒载体,可以根据实验需要选择不同的载体。
2.DNA的准备工作:将所需的外源基因片段克隆到载体中,并根据需要设计适当的启动子和终止子。
确保DNA质粒提取纯度高,并使用合适的工具加以验证。
3. 细胞准备:选择合适的干细胞,常用的有胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)等。
干细胞需要在培养基中进行适当的扩增和传代。
4.干细胞培养:将干细胞在无细胞培养基中培养,以保持其干性。
培养基中添加相应的生长因子和细胞因子来促进细胞生长和增殖。
5.转染干细胞:将准备好的质粒载体与干细胞一起转染进入干细胞中,常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒介导转染法。
根据研究需要选择合适的转染方法。
6.选择转染细胞:转染后,使用选择性抗生素或选择性标记物来选择转染成功的细胞,例如使用抗生素筛选,只有带有外源基因的干细胞才能在含有抗性抗生素的培养基中存活。
7.干细胞稳定化:将选中的转染细胞继续在无细胞培养基中培养,并经历几个传代。
在这个过程中,通过监测外源基因的表达情况来确定是否稳定表达。
8. 验证外源基因的稳定表达:使用适当的表达分析方法(如PCR、Western blot和荧光显微镜等),检测外源基因的稳定表达情况。
确保外源基因能够在转染的干细胞中稳定地表达。
9.功能验证:在转染干细胞中验证外源基因的功能。
根据实验需要,可以通过细胞增殖实验、细胞分化实验等来验证外源基因的功能。
10.数据分析和报告编写:整理和分析实验结果,并按照科学报告的形式撰写报告,描述实验过程和结果,包括外源基因的稳定表达情况和功能验证结果。
以上是干细胞稳定转染的一般步骤。
需要根据实际情况和实验要求调整和优化步骤,确保转染成功率和所需的目标基因的稳定表达。
(完整)病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤:1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理:慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成,即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因.将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞,即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
lipo3000质粒转染步骤
lipo3000质粒转染步骤引言:质粒转染是生物学实验中常用的一种技术手段,用于将外源基因导入到细胞内,从而实现对目标基因的研究。
lipo3000是一种常用的质粒转染试剂,具有高效、快速和稳定的特点。
本文将详细介绍lipo3000质粒转染的步骤及相关操作注意事项。
一、实验前的准备工作在进行lipo3000质粒转染之前,需要准备以下实验材料:1. 质粒:根据实验需要选择合适的质粒,如表达载体、报告载体等。
2. 细胞培养基:根据实验需要选择适合细胞的培养基,如DMEM、RPMI-1640等。
3. 细胞:选择合适的细胞株,如HEK293、HeLa等。
4. lipo3000试剂盒:包括lipo3000试剂、Opti-MEM培养基等。
5. 离心管、无菌移液器、培养皿等实验器材。
二、lipo3000质粒转染步骤1. 细胞的预处理:将细胞培养在含有10%胎牛血清的培养基中,使其在培养皿中达到80%~90%的密度。
2. 质粒和lipo3000试剂的混合:将所需质粒和lipo3000试剂分别按照试剂盒说明书的要求稀释至适当浓度。
然后,将等体积的质粒和lipo3000试剂混合,并轻轻摇晃管子使其充分混合。
3. 混合物的静置:将混合物静置15-30分钟,使质粒和lipo3000试剂充分结合形成复合物。
期间避免剧烈震荡或振荡。
4. 细胞的转染:将预处理好的细胞用细胞培养基洗涤2次,使细胞附着在培养皿上。
然后,加入含有混合物的培养基,使细胞与质粒和lipo3000试剂的复合物接触。
注意避免气泡的产生。
5. 转染液的去除:将转染液去除,用含有10%胎牛血清的培养基洗涤细胞,以去除未吸附的质粒和lipo3000试剂。
6. 细胞的培养:将洗涤后的细胞加入新鲜的培养基中,继续培养。
根据实验需要,可以添加相应的筛选剂或诱导剂。
三、操作注意事项1. 在操作过程中,保持实验环境的无菌,减少外源污染的可能性。
2. 严格按照试剂盒说明书的要求操作,避免试剂的浓度过高或过低。
稳定转染步骤范文
稳定转染步骤范文稳定转染是指将外源基因或RNA通过载体引入目标细胞,并使其在细胞中稳定存在和表达。
稳定转染在生物医学研究和基因治疗等领域扮演着重要的角色,因为它可以使目标细胞长期稳定地表达外源基因,以实现相关研究或治疗的目的。
下面是稳定转染的一般步骤:1.选择适当的载体:选择合适的载体是稳定转染的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和质体等。
质粒是最常用的载体之一,它具有较大的载体容量,便于实验操作,且没有传染性。
病毒能够高效转染目标细胞,但需要确保安全性,避免病毒复制和毒性对细胞的影响。
质体是构建稳定转染细胞株的另一种选择,其使用较为复杂,但稳定性较好。
2.插入目标基因:将目标基因插入到选定的载体中。
基因的插入可以通过限制性内切酶切割和连接等方法实现。
确保插入的基因与载体配对后形成完整的DNA分子。
3.构建稳定转染细胞株:将含有插入目标基因的载体转染入目标细胞中。
转染方法包括化学法、电穿孔法、微粒轰击法和病毒感染法等。
其中,化学法最为常用,其通过化学品改变细胞膜的通透性来促进外源基因的转染。
4.选择处理:添加适当的选择抗生素或标记物来选择转染成功的细胞。
常用的选择剂包括抗生素G418和新霉素等。
由于稳定转染的成功率较低,这一步骤的目的是选择和培养含有插入基因的稳定转染细胞克隆。
5.扩增和筛选稳定转染细胞:将转染成功的细胞株进行扩增培养,并通过PCR、荧光显微镜观察和免疫标记等方法筛选出稳定转染的细胞株。
6. 确认并分析稳定转染细胞株:鉴定细胞株中目标基因的表达情况。
可以通过Western blot、RT-qPCR等方法来检测外源基因的表达水平,并通过细胞功能实验来研究基因在细胞中的功能。
7.建立稳定转染细胞株库:将稳定转染的细胞株进行存储和保存,以备将来使用。
总结:稳定转染是通过引入外源基因或RNA,使其在目标细胞中长期稳定地表达。
稳定转染的步骤包括选择适当的载体、插入目标基因、转染目标细胞、选择处理、扩增和筛选稳定转染细胞、确认并分析稳定转染细胞株以及建立稳定转染细胞株库等。
脂质体转染技术步骤
脂质体转染实验步骤脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1:1)。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做。
先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类:COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤(方法一):(1):取6孔培养板,向每孔中加入2ml含(1-2) x 10^5个细胞的培养基,37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
(2)转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。
A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100ul。
B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100ul。
轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。
(3)转染准备:用2ml不含血清培养基漂洗2次,再加入1ml不含血清培养基。
(4)转染:把A/B复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h,吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养。
(5)其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
(6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤(方法二):●∙∙∙∙∙∙∙ 将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。
●∙∙∙∙∙∙∙ 在试管中配制DNA-脂质体复合物。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验(精华)一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类:物理介导方法:电穿孔法、显微注射和基因枪;化学介导方法:如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法:有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。
但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。
需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节(见后文)。
二、转染操作流程(以常用的6孔板为例)(1) 细胞培养:取6孔培养板,以3x104/cm2密度铺板,37℃5%CO2培养箱中培养至70%~90%汇合。
(不同细胞略有不同,根据实验室优化的条件进行,汇合过分,转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备:在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液:用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂,终量100μL;轻轻混合A、B液(1:1混匀),室温中置15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。
(3) 转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中(缓慢滴加),轻轻摇匀,37℃温箱置6~8小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清,因为血清会影响复合物的形成。
B.一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题,转染用的培养液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被认为会降低转染效率,转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
悬浮细胞的稳定转染技术
悬浮细胞的稳定转染技术悬浮细胞的稳定转染技术悬浮细胞是一类不附着于固体基质的细胞,常见于血细胞、免疫细胞和肿瘤细胞等。
与附着细胞相比,悬浮细胞具有更高的挑战性,因为其在细胞培养和基因编辑等方面存在许多难题。
稳定转染是一种常见的遗传改造方法,能够在细胞中引入外源基因,为研究基因功能和治疗疾病提供重要工具。
然而,悬浮细胞的稳定转染技术相对复杂,需要克服一系列困难与挑战。
一、悬浮细胞的特殊性对稳定转染构成挑战1. 被吞噬作用:悬浮细胞具有较强的吞噬功能,其聚集和吞噬外源DNA的能力使得外源基因的转入困难。
2. 细胞毒性:某些稳定转染方法可能对悬浮细胞产生细胞毒性,导致细胞死亡或失去功能。
二、常见的悬浮细胞稳定转染技术1. 慢病毒载体:慢病毒是一类具有基因转导潜力的病毒,通过将外源基因集成到宿主基因组中实现长期稳定表达。
慢病毒转染技术在悬浮细胞中应用广泛,但需要特定细胞系和特殊培养条件。
2. 原核表达系统:原核表达系统如大肠杆菌表达系统(E. coli)和酵母表达系统(Saccharomyces cerevisiae)可以在大规模中产生目标蛋白,然后通过细胞破碎等手段将蛋白转染到悬浮细胞中。
3. 内源启动子驱动:利用内源启动子驱动外源基因的表达,可通过转染质粒或载体进入悬浮细胞。
这种方法依赖于细胞的自然基因调控网络,对于一些细胞系来说效果较好。
4. 电穿孔技术:电穿孔技术通过电场脉冲使细胞膜短暂开放,使DNA 进入细胞内部。
这种方法适用于各种类型的细胞,但需要注意对细胞的损伤程度。
三、优化悬浮细胞稳定转染技术的关键因素1. 选择合适的转染方法:根据特定的细胞类型和研究需求选择合适的转染方法,综合考虑转染效率和细胞毒性等因素。
2. 优化转染条件:对转染条件进行测试和优化,包括DNA和转染试剂的浓度、转染时间和转染温度等因素。
3. 细胞培养条件的调整:确保细胞培养条件的适宜性,包括培养基的配方、培养温度和培养时间等。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制:方案一:300mgG418加入3ml PBS溶液,浓度为100mg/ml,完全溶解后,0.22um过滤,-20℃保存。
方案二:(1)配制1M HEPES:23.8g HEPES(缓冲能力更强)粉末溶于100ml ddH2O,10NNaOH(加量较多)调节pH至7.3,过滤除菌(较难过滤),4℃保存,终浓度为1mol/L。
(2)5g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3),终浓度为500mg/ml,-20℃保存。
注:实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基:用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板,每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基),每个浓度4个重复,则每次换液需各个浓度培养基4ml,现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养:将冻存的细胞复苏培养,,传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板(200/孔),12h换液,加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度:将培养孔中培养基吸除,PBS洗涤一次,每孔加入不同浓度筛选培养基,隔天更换一次筛选培养基,培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注:实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
转染步骤
DNA转染步骤1 转染前一天接种细胞于6孔板,0.5-2×105每孔,2ml无抗生素培养基每孔,第二天转染时细胞达到90-95%每孔。
2 转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。
3 A液:DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀。
4 B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静止5min。
5 B液加入A液,用枪轻轻混匀,室温静止20min。
6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加变前后左右十字交叉摇晃。
7 孵箱37℃培养48h(转染时间待定)。
8 第二天看细胞状态来决定是否换液。
9 同时设立细胞对照组,空白转染组。
siRNA转染步骤1 转染前一天接种细胞于6孔板,2ml无抗生素培养基每孔,第二天转染时细胞达到30-50%每孔。
2 转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。
3 A液:siRNA 5ul(共100pmol)加入245ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀。
(siRNA按照说明书稀释)4 B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静止5min。
5 B液加入A液,用枪轻轻混匀,室温静止20min。
6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加变前后左右十字交叉摇晃。
7 孵箱37℃培养48h(转染时间待定)。
8 第二天看细胞状态来决定是否换液。
9 同时设立细胞对照组,空白转染组。
实验室通常用细胞培养瓶与孔板实验室通常用细胞培养瓶与孔板。
shrna稳转细胞株 构建 步骤
shrna稳转细胞株构建步骤
构建shrna稳转细胞株的步骤如下:
1. 设计并合成shrna。
2. 构建包含shrna的表达载体,常用的是慢病毒载体。
3. 包装慢病毒,这一步通常需要借助病毒包装系统完成。
4. 滴度测定,测定病毒滴度是制备稳定转染细胞株的重要步骤。
5. 慢病毒感染,将目的细胞与慢病毒混合培养,使病毒进入细胞并整合到宿主染色体中。
6. 筛选稳定表达细胞株,在感染72小时后开始加入筛选药物,每隔2天重新换液并加入筛选药物。
药物筛选需至少持续14天,直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。
7. 鉴定稳转细胞株,对筛选到的稳定表达细胞株进行鉴定,验证其是否稳定表达目的基因。
以上步骤仅供参考,建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
转染步骤及经验
转染步骤及经验转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。
本文将介绍转染的步骤及经验,并提供一些实用的技巧,旨在帮助读者顺利完成转染实验。
一、实验准备在进行转染实验前,必须做好充分的实验准备工作。
以下是一些关键准备步骤:1.1 细胞培养与处理- 培养适量的目标细胞,并确保其良好的生长状态。
- 处理细胞,使其处于适宜转染的状态。
例如,对于贴壁细胞,可以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。
1.2 载体准备- 准备带有目标基因的载体。
这可以是质粒、病毒等。
- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。
1.3 转染试剂- 准备合适的转染试剂,如转染剂、离子可溶液等。
不同类型的细胞需要使用不同的试剂。
二、转染步骤转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。
以下是一般的转染步骤:2.1 细胞处理- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。
- 注意不要创建过高的转染细胞密度,以免影响转染效率。
2.2 与载体混合- 将载体与转染试剂混合,形成载体-试剂复合物。
根据实验需要可做不同浓度的复合物。
- 注意操作过程中避免产生气泡,以防止对细胞的损伤。
2.3 加入转染复合物- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中,确保复合物均匀分布在细胞表面。
- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。
2.4 培养细胞- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。
- 在培养期间,根据实验设计进行后续处理,如观察表型、提取蛋白等。
三、经验分享3.1 优化试剂浓度- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同,需要根据实验经验进行优化。
试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。
3.2 选择合适的转染方法- 根据研究目的和所用试剂的特性,选择合适的转染方法。
常见的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。
3.3 控制转染时间和温度- 不同细胞对转染复合物的吸收速度有差异,应该根据细胞类型和试剂特性确定合适的转染时间和温度。
悬浮细胞的稳定转染
悬浮细胞的稳定转染一、悬浮细胞的特点及转染难度悬浮细胞是指在培养基中不附着于任何基质上而自由漂浮的细胞,如淋巴细胞、造血干细胞等。
与附着细胞相比,悬浮细胞具有以下特点:形态多样性大、生长速度快、生长周期短、易于扩增和保存等。
然而,由于悬浮细胞不附着于任何基质上,因此其对外界环境变化的敏感性较高,同时其膜结构也较为复杂,这使得悬浮细胞的转染难度较大。
传统的化学法和电穿孔法虽然可以用于附着细胞的转染,但对于悬浮细胞来说并不适用。
二、利用病毒载体进行稳定转染为了解决悬浮细胞转染难题,科学家们发展出了多种方法。
其中最常用的方法是利用病毒载体进行稳定转染。
病毒载体是指将目标基因插入到病毒基因组中,并通过病毒复制的方式将目标基因传递到宿主细胞中的一种工具。
常用的病毒载体包括慢病毒、腺病毒、巨细胞病毒等。
利用病毒载体进行稳定转染的步骤如下:1.构建目标基因表达载体首先需要将目标基因插入到合适的表达载体中,常用的表达载体包括pCDH、pLenti等。
插入后需要进行验证,确保目标基因插入正确并能够正常表达。
2.包装成适合悬浮细胞转染的病毒将构建好的表达载体与包装质粒一起转染到293T等包装细胞中,经过多次传代培养后可收集到高滴度、高纯度的病毒液。
3.悬浮细胞转染将收集到的病毒液与悬浮细胞混合后,经过一定时间内培养,使得病毒能够顺利地进入悬浮细胞内部并整合到宿主基因组上。
最后通过筛选和鉴定,得到稳定且高效地表达目标基因的细胞株。
三、利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑除了利用病毒载体进行稳定转染外,还可以利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑。
CRISPR/Cas9技术是一种新兴的基因编辑工具,其原理是利用Cas9酶与RNA分子形成复合物,识别并切割目标DNA序列,从而实现对基因组的精准编辑。
利用CRISPR/Cas9技术进行悬浮细胞转染的步骤如下:1.设计sgRNA首先需要设计适合悬浮细胞的sgRNA序列,并通过体外转录和纯化得到sgRNA。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度,不同细胞系具有不同的药物敏感度,因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度.药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡,如G418一般需要7天,而puro一般时间很短,只需要3—4天即可。
2、药物筛选注意事项(1)药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢,因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法,加药时间一般为72h空白对照加药筛选时,最好设置空白对照,即未转染细胞同时加药,待空白对照中细胞全部死亡,转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完,但还需继续加药.(2)换液如果加药后,细胞死亡较多,需及时换液,以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡.另外,随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低,因此,每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记,不管是以下哪种筛选克隆的方法,都应该选择带有荧光较强的细胞克隆,因为加药筛选时,可能会产生耐药性的细胞,因此最好选择带有荧光较强的细胞.若是转染的质粒不带有荧光,那么只能盲挑。
不管是带有或者不带有荧光标记,都应该挑出克隆后进行验证,验证存在不成功的概率。
因此,挑克隆时,应尽量多挑几个克隆,20个左右.4、稳定克隆筛选步骤(1)有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞(一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行)用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数(如果细胞数量过大,可先稀释后计数)c)计算后,用枪头吸取约200个细胞(其中有部分为死细胞)到10ml培养液中充分混匀,剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中,每孔100ul,这样有的孔就可能只有一个细胞,过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液(一个96孔板得到的克隆可能较少,可以用同样的方法做2—3个96孔板)e)待细胞贴壁后,逐孔在显微镜下观察,没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉,只有一个细胞的孔划勾,以做好标记,如果只有一个细胞的孔数量太少,可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
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稳定转染细胞株的制备
带质粒的大肠杆菌的激活和扩增
(1)取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻,或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
(2)LB培养基的制备按照如下配方配制
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,高温高压灭菌后室温保存,使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)
(3)LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌,待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀,分别倒入6-7个培养皿中,用封口膜封边,并倒置放于4℃保存。
(4)扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上,待凉干后,用封口膜将培养皿封闭,然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃),根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌,待长出后,用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中,放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜,第二天观察,待LB液体培养基变浑浊后,4℃冰箱保存,以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取
准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
(1)取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
(2)5,000×g离心10分钟,弃去上清液,将试管倒置在滤纸上空干。
(3)取出质粒提取盒,用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
(4)加入3ml细胞裂解液,轻轻摇晃试管混匀,室温下孵育3分钟,产生白色絮状沉淀,然后加入5ml中和液混匀
(5)将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管,将上述试管中裂解后的液体倒入兰管,孵育2分钟,1500×g离心5分钟,效果不佳的话可再离心一次,离心液待用。
(6)将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管,取上述离心液倒入白管,1500×g离心3分钟,弃去离心液。
(7)在白管中加入5ml内毒素清洗液(需加异丙醇),1500×g离心3分钟,弃去离心液,在白管中再加20ml柱洗液(含有乙醇),1500×g离心5分钟,弃去离心液后,继续1500×g离心10分钟,以保证彻底除去乙醇。
(8)取出白管,在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴,以保证去除试管中的乙醇,并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。
(9)把白管放入一个新的50ml离心管中,加入600µl无核酸酶的水(要把水加到白管中的DNA结合膜上),然后1500-2000×g离心5分钟
(10)收集离心管中的滤液,并转到1.5mlEP管中,密封,-20℃保存。
提取质粒的DNA电泳鉴定
(1)制胶取0.15g琼脂糖,15ml 1×TAE混匀,微波炉加热20分钟,使之熔化,待自然冷却60-70℃时,加入0.25µl EB,轻轻混匀。
(2)将冷却至约60℃的凝胶倒入准备好的胶床内,厚度约5mm,室温静置1h,待胶固化后,置于电泳槽中,样品端位于负极。
(3)倒入1×TAE缓冲液,覆盖住胶面,拔起梳子
(4)在样品中按1:6体积比加入上样缓冲液,混匀。
(5)在加样孔中分别加入Marker和样品。
(6)盖上电泳槽,通上电,电压80v,时间约20-25min,开始电泳。
(7)电泳结束,取出凝胶,照相后观察。
提取质粒后浓度的测定
(1)取EP管,标上记号。
(2)其中一个加双重蒸馏水80µl,其余加样品80µl(样品按:提取质粒2µl ,双重蒸馏水78µl 混匀而成).
(3)用核酸计算器测定,并记录结果。
(4)经测定,PCI-neo-PDCD重组质粒的浓度为764ng/µl, PCI-neo-空质粒的浓度为524 ng/µl.
稳定转染细胞株的筛选
(1)G418配制取1g G418,加入10mlPBS溶液,浓度为100mg/ml,完全溶解
后,过滤分装到1mlEP管中,密封,-20℃保存。
(2)浓度梯度试验确定G418的最佳筛选浓度用培养基把G418稀释成100µg/ml、200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml、600µg/ml、700µg/ml、800µg/ml、900µg/ml、1000µg/ml不同筛选浓度。
选对数期DU145细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml细胞悬液,铺24孔板,每孔1ml ,过夜使之贴壁,然后换液,换成含不同浓度G418的培养基,培养10-14天,每3天换一次液,在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度,筛选时比该浓度再高一个级别,维持培养时使用筛选浓度的一半。
(3)细胞转染取对数期前列腺癌DU145细胞,消化后用无双抗10﹪血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml),接种到35mm培养皿中过夜,培养到70%汇合率,进行转染。
取出培养皿,吸去培养皿中的培养液,并每皿加入RPMI 1640培养液约0.5ml重复冲洗细胞两遍,而后每皿加入RPMI 1640培养液1.5ml,转染复合物混合液0.5ml. 轻轻混匀,放入37℃,5%CO2孵育箱中培养6 h左右,进行换液,换成含10%血清的普通培养基,在37℃,5%CO2孵育箱中继续培养24h左右.
转染复合物的制取:
250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000(混合5min)
250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.9µl空质粒(混合5min)
上述二者混合后,室温静置20min,即为空质粒的转染复合物。
250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000(混合5min)
250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.31µlPDCD5重组质粒(混合5min)上述二者混合后,室温静置20min,即为PDCD5重组质粒的转染复合物。
注: 转染复合物一旦形成,应立即加入培养皿中进行细胞转染。
(4)稳定转染细胞株的筛选
从37℃,5%CO2孵育箱中取出培养皿,弃去含转染试剂的培养基,用PBS 冲洗细胞2遍,胰蛋白酶消化,接种1/2的细胞到100 mm培养皿中,加入含500 µg/ml G418的新鲜培养基,每2-3天更换一次新的筛选培养基,每天观察细胞的死亡情况。
当正常细胞完全死亡后,换用新的不含G418的培养基培养。
每天观察细胞生长状态。
在细胞达到60%汇合率时再用含500 µg/ml G418的培养基筛
选一次。
当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养(转染后10-12天左右)。
以后每隔4-5天再用含500 µg/ml G418的培养基筛选。
直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品(约转染后15天左右)。
以后继续培养时加入的G418浓度降一半。