稳定转染步骤

稳定转染细胞株的制备

带质粒的大肠杆菌的激活和扩增

（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。

（2）LB培养基的制备按照如下配方配制

胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L

酵母提取物(Yeast extract) 5g/L

氯化钠(NaCl) 10g/L

用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)

（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。

（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。

质粒的提取

准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。

（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。

（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。

（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀

（5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。

（6）将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。

（7）在白管中加入5ml内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g离心3分钟，弃去离心液，在白管中再加20ml柱洗液(含有乙醇)，1500×g离心5分钟，弃去离心液后，继续1500×g离心10分钟，以保证彻底除去乙醇。

（8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。

（9）把白管放入一个新的50ml离心管中，加入600µl无核酸酶的水(要把水加到白管中的DNA结合膜上),然后1500-2000×g离心5分钟

（10）收集离心管中的滤液，并转到1.5mlEP管中，密封，-20℃保存。

提取质粒的DNA电泳鉴定

（1）制胶取0.15g琼脂糖，15ml 1×TAE混匀，微波炉加热20分钟，使之熔化，待自然冷却60-70℃时，加入0.25µl EB,轻轻混匀。

（2）将冷却至约60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约5mm,室温静置1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。

（3）倒入1×TAE缓冲液，覆盖住胶面，拔起梳子

（4）在样品中按1：6体积比加入上样缓冲液，混匀。

（5）在加样孔中分别加入Marker和样品。

（6）盖上电泳槽，通上电，电压80v,时间约20-25min,开始电泳。

（7）电泳结束，取出凝胶，照相后观察。

提取质粒后浓度的测定

（1）取EP管，标上记号。

（2）其中一个加双重蒸馏水80µl，其余加样品80µl(样品按:提取质粒2µl ，双重蒸馏水78µl 混匀而成).

（3）用核酸计算器测定，并记录结果。

（4）经测定，PCI-neo-PDCD重组质粒的浓度为764ng/µl, PCI-neo-空质粒的浓度为524 ng/µl.

稳定转染细胞株的筛选

（1）G418配制取1g G418,加入10mlPBS溶液，浓度为100mg/ml,完全溶解

后，过滤分装到1mlEP管中，密封，-20℃保存。

（2）浓度梯度试验确定G418的最佳筛选浓度用培养基把G418稀释成100µg/ml、200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml、600µg/ml、700µg/ml、800µg/ml、900µg/ml、1000µg/ml不同筛选浓度。选对数期DU145细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml细胞悬液，铺24孔板，每孔1ml ，过夜使之贴壁，然后换液，换成含不同浓度G418的培养基，培养10-14天，每3天换一次液，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度，筛选时比该浓度再高一个级别，维持培养时使用筛选浓度的一半。

（3）细胞转染取对数期前列腺癌DU145细胞，消化后用无双抗10﹪血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml)，接种到35mm培养皿中过夜，培养到70%汇合率，进行转染。取出培养皿，吸去培养皿中的培养液，并每皿加入RPMI 1640培养液约0.5ml重复冲洗细胞两遍，而后每皿加入RPMI 1640培养液1.5ml,转染复合物混合液0.5ml. 轻轻混匀，放入37℃，5％CO2孵育箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右.

转染复合物的制取：

250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000（混合5min）

250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.9µl空质粒（混合5min）

上述二者混合后，室温静置20min，即为空质粒的转染复合物。

250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000（混合5min）

250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.31µlPDCD5重组质粒（混合5min）上述二者混合后，室温静置20min，即为PDCD5重组质粒的转染复合物。

注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）稳定转染细胞株的筛选

从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS 冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm培养皿中，加入含500 µg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含500 µg/ml G418的培养基筛