电转染标准步骤
Neon电转染操作步骤
Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。
该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等影响电穿孔效率的因素电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。
对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。
电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。
缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。
其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。
1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip),the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。
2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的culture medium，DPBS等。
3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum andsupplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
电转细胞实验转染细胞方法
电转细胞实验转染细胞方法
1) 细胞铺板，使细胞在电转当天有70~90% 汇合率；
2) 配置RNP 反应体系
3) 20 分钟之内，用胰酶消化细胞，并洗去迹量的胰酶（胰酶残留
会造成其对Cas9 蛋白的降解），重悬细胞到10 mL 培养基中，
并计数；
4) 取5 倍于0.2~1×10 6 细胞量到新的EP 管中，500×g 离心5 分钟收集细胞，并用PBS 清洗一次细胞，重新离心；
5) 使用5 倍于30 μL 电转液重悬细胞；
6) 准备预先在24 孔（0.5 mL）或6 孔（2 mL）板中加入适量培养基，用于后期电转细胞培养；
7) 将30 μL 电转液重悬细胞加入到各RNP 反应EP 管中，并轻轻混合；
8) 取60 μL RNP 和细胞混合液到吉玛电转仪（96 孔电转），使用300V，电击6 次；
9) 立即将电转后细胞转移到培养板中，在细胞培养箱中培养48~72小时。
电穿孔技术
电穿孔技术电穿孔缓冲液：配方1：200mM/L葡萄糖,5mM硫酸镁2mM/L疏基乙醇20mM/LTris-HCI ,pH值7.6Universal Electroporation Solution通用电转染缓冲液性能特点：1. 显著提高转染效率和细胞存活率2. 适用于难转染细胞等几乎所有细胞类型3. 与所有电融合/电穿孔仪兼容产品货号：UES0001产品规格：1ml保存：Universal Electroporation Solution保存于4度建议-20度长期保存保质期：正确的使用和保存条件下，保质期为6个月电转染次数：1ml Universal Electroporation Solution用0.4cm电极杯可进行5组实验用0.2cm电极杯可进行10组实验电转染条件：电压260V电容950μF操作步骤：1．收集细胞：用胰酶消化细胞，将细胞培养液吸入到15ml离心管中，1000rpm,5min，弃其上清。
2．用不含血清的培养液洗涤一次，弃其上清。
3．取2～10ug质粒加入到100ul电转缓冲液中，充分混匀。
4．用100ul混有质粒的电转缓冲液充分溶解细胞，转入0.2cm电转导入杯中。
5．将电转导入杯放入样品槽中，释放电脉冲，电击参数按电容1000 mF，电压150-500 V，间隔20V取值，取得最佳效果。
6．立即取出电击杯，分别用一次性吸管将混和液转移至加有完全培养基的一次性细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
电穿孔法转染哺乳动物细胞来源： 发布时间：2009-08-31 查看次数：1935站长注：下文是发表于Nature Methods中的一篇关于电穿孔转染方法的文章，站长对其作了注释，方便大家理解。
电穿孔转染理论上可转染所有的组织细胞，因此对其他如脂质体、磷酸钙沉淀等方法转染效果不明显的细胞可选用此方法。
电转过程中，最重要的就是电穿孔仪的电压、电容以及与电泳缓冲液的选择。
提到电转仪，最出名的恐怕就属BIO-RAD了，他在1986年推出了世界上第一台电穿孔仪，并发布了多种细胞仪电转过程中的电压，电容，电转缓冲液等可省却大家很多的摸索过程，具体资料可到其主页上查找相关Nature Methods 3, 67 - 68 (2006)Transfection of mammalian cells by electroporationPulsed electrical fields can be used to introduce DNA into a wide variety of animal cells1, 2. Electroporation works well with cell lines that are refractive to other techniques, such as calcium phosphate–DNA coprecipitation. But as with other transfection methods, the optimal conditions for electroporation of untested cell lines must be determined experimentally.电穿孔转染可用于磷酸钙转染效率低下的细胞，具有操作简便，转染效率高等优点，但对于不同的细胞，其转染条件有很大的不同，需要进行摸索。
电转染标准步骤
电转染标准步骤
1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。
对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。
若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。
（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。
经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。
电穿孔转染质粒DNA
质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。
2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。
再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。
3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。
然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。
待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。
4. DNA片断3凸端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul。
,加水至19ul。
然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。
5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。
40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。
CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。
细胞电转染
细胞电转染电转的简介 (1)电穿孔转染的基本原理及过程 (1)电穿孔转染条件的选择 (1)1 电参数 (1)2脉冲时程 (2)3 脉冲次数 (2)4 细胞因素 (3)5 质粒因素 (3)6 温度 (4)7．缓冲液以及培养液的成 (4)仪器常用键区介绍 (5)Neon TM电转染一般流程 (7)电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。
这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。
它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。
尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。
电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。
其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。
再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。
一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。
电穿孔转染条件的选择1 电参数电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。
对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。
电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。
电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。
t细胞电转染流程
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电转染操作流程
Neon TM电转染一般流程1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达到70-90%。
2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl ，放于37℃培养箱预热。
（注：使用其他孔数培养板或者100µl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750µl 胰酶消化3min ，加入750µl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。
4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。
5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。
6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。
轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。
（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低）7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。
所用细胞浓度、DNA 和接种体积见下表1）。
8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。
9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。
10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10µl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。
将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。
11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。
12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。
13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。
将培养板放到培养箱培养。
14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。
注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。
电击法转染的原理
电击法转染的原理
电击法转染是一种常用的基因转染技术，它通过应用电脉冲的方法将外源基因导入细胞内。
该技术可用于基因治疗、基因表达研究以及生物工程领域的实验中。
电击法转染的原理基于细胞膜的特性。
细胞膜是由脂质双分子层构成的，并且具有特定的电导性。
电击法转染利用外部电场作用于细胞膜，使其发生暂时性的通透性改变，从而使外源DNA能够进入细胞内。
具体步骤如下：
1. 收集目标细胞，并将其准备在适宜的培养基中。
2. 预先准备含有外源基因的转染剂（例如质粒DNA）溶液。
3. 将细胞和转染剂溶液混合，并将混合物装入一个特定的电击腔室。
4. 通过电极将电场施加到电击腔室中，产生电脉冲。
5. 电脉冲的作用使细胞膜发生短暂的通透性改变，允许外源基因进入细胞内。
6. 删除电极后，细胞膜恢复正常状态。
7. 细胞进一步培养，以确保外源基因成功表达。
电击法转染的关键是控制电场参数，包括脉冲幅度、脉冲宽度和脉冲频率等。
这些参数的选择取决于目标细胞的特性和所需的转染效率。
需要注意的是，电击法转染对细胞有一定的毒性，并且并非所有类型的细胞都适合该技术。
因此，在选择适用的细胞系和优化转染条件方面，需要进行相关的实验验证。
Gene Pulser Xcell电穿孔系统 HUVEC内皮细胞转染
电穿孔转染
仪器：Gene Pulser Xcell电穿孔系统，2mm间隙电击杯（装0.1-0.4ml液体）试剂：opti-MEM无血清培养液，压过的PBS，压过的dd水，75%乙醇，质粒/siRNA 细胞：密度1-5x10＾6
步骤：
1.1瓶f12细胞。
1mlPBS洗2次，1ml胰酶消化3分钟，拍打，吹打，加终止液终止消化，加入15ml离心管，800r/5min离心。
吸净上清，用n组x
400ul opti-MEM重悬。
2.将质粒/miRNA加入电击杯，再将400ul细胞悬液加入电击杯，吹匀，注意不要吹出气泡。
或者将质粒/miRNA加入15ml离心管中的细胞悬液中，再转移到电击杯。
3.设置好参数：电压200V，电容800uF，电阻无穷大，间距2mm。
将点击杯放入仪器，点击pulse电击，取出点击杯，室温放置10min。
4.铺板或转移到培养瓶中。
5.24h后，加药处理。
注：如果要拍荧光，注意HEK-293细胞不好固定，PBS洗涤时很容易被冲掉。
电击杯的清洗：自来水冲洗，用刷子刷干净，一定不要有残留，否则影响下一次实验。
在盒子里倒入75乙醇涮一下，随后放在铝盒中，立起来，紫外照射1h，随后盖上盖子保存。
细胞转染实验
细胞转染实验简介细胞转染是一种将外源基因或荧光探针引入细胞的技术，用于研究基因功能、蛋白质表达以及信号通路等。
本文将为您介绍细胞转染实验的基本原理、实验步骤以及常见注意事项。
基本原理细胞转染是一种通过改变细胞外液环境，使细胞吸收外源基因或荧光探针的技术。
转染可采用多种方式实现，包括化学转染、电转染、病毒转染等。
不同的转染方法适用于不同类型的细胞和研究目的。
在化学转染中，常用的转染试剂有脂质体和阳离子聚合物。
脂质体是由磷脂和胆固醇组成的小囊泡，可以包裹外源基因形成脂质体-基因复合物。
阳离子聚合物是带正电荷的聚合物，可以和DNA形成复合体进入细胞。
电转染是利用高压脉冲将DNA导入细胞。
通常使用电穿孔仪产生的短暂高压电场，使细胞膜通透性增加，从而使DNA进入细胞。
病毒转染是将外源基因植入病毒载体中，通过感染细胞，使外源基因整合到细胞染色体中。
实验步骤1. 准备细胞选择合适的细胞系进行转染实验。
不同细胞系对转染方法和试剂的适应性有所差异。
常见细胞系如293T、HeLa、CHO 等。
2. 培养细胞将选定的细胞系按照相应的培养条件在细胞培养皿中培养至达到合适的密度，一般为70-90%的密度。
细胞应确保处于快速生长期，以提高转染效率。
3. 转染试剂的选择根据实验的需要选择合适的转染试剂。
常见的转染试剂有脂质体试剂（如Lipofectamine™）和阳离子聚合物试剂（如PolyJet™）。
4. 转染实验操作将所需的转染试剂加入适量的培养基中，并充分混合。
注意避免产生气泡，以免影响转染效率。
将转染试剂溶液缓慢滴加到含有细胞的培养皿中。
5. 恢复培养条件将含有转染试剂的培养皿置于恢复培养条件下，通常为37℃、5% CO2的培养箱中。
细胞需要一定时间来恢复并表达外源基因。
6. 分析转染效率通过荧光显微镜观察细胞是否发出荧光信号。
如果转染的是荧光探针，则直接观察细胞是否发出特定颜色的荧光。
如果转染的是外源基因，则需要进一步通过PCR或Western blot 等技术来验证外源基因是否成功表达。
电转化方案
一、酵母菌电转化方案:方案一。
1、负80度取出涂平板。
30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟5、加0。
5ml 1M DTT 再摇15分钟6、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬8、每40ul一个转化体系分装9、转化条件1。
5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。
方案二、1、负80度取出涂平板。
30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬6、每40ul一个转化体系分装7、转化条件1。
5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul8、加1000ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，9、30度温浴1~2小时，不能摇动。
然后涂在选择培养基上。
二、怎么样选择电转仪（电转仪的功能与适用对象）美国著名BTX是专业的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。
自从1983年起，苛求的科研工作者就已经把BTX产品作为电融合、转基因等应用领域的首选仪器。
除了占世界领导地位的电融合、转基因系统外，BTX的产品还包括多达25种相关的配件，其中有多种专业的电极，给用户更多的选择。
电转化方案
一、酵母菌电转化方案:方案一。
1、负80度取出涂平板。
30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中 30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟5、加0。
5ml 1M DTT 再摇15分钟6、加20ml双蒸水 4度3500rpm离心半分钟第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用 20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬第三次沉淀用 1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬8、每40ul一个转化体系分装9、转化条件1。
5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ngDNA/reaction<5ul10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。
方案二、1、负80度取出涂平板。
30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中 30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、加20ml双蒸水 4度3500rpm离心半分钟5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用 20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬第三次沉淀用 1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬6、每40ul一个转化体系分装7、转化条件1。
5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ngDNA/reaction<5ul8、加1000ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，9、30度温浴1~2小时，不能摇动。
然后涂在选择培养基上。
二、怎么样选择电转仪（电转仪的功能与适用对象）美国著名BTX是专业的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。
自从1983年起，苛求的科研工作者就已经把BTX产品作为电融合、转基因等应用领域的首选仪器。
除了占世界领导地位的电融合、转基因系统外，BTX的产品还包括多达25种相关的配件，其中有多种专业的电极，给用户更多的选择。
电转染过程和原理
电转染过程和原理
电转染是一种常用于对细胞进行基因转染的技术，它利用电场作用使DNA分子从胞外直接转移到细胞内。
电转染主要用于将外源的DNA或RNA导入到目标细胞中，实现基因转移、基因敲除或基因表达。
电转染的原理基于以下几个步骤：
1. 基质制备：将待转染的DNA或RNA溶解在缓冲液中，形成转染基质。
2. 细胞准备：将待转染的细胞收集并洗涤，使细胞悬浮于含有缓冲液的试管中。
3. 电转染：将经过洗涤的细胞与转染基质混合，然后放入电转染装置中。
电转染装置是由平行电极组成的装置，其中一个电极位于细胞上方，另一个电极位于细胞下方。
通常，细胞与电极之间的距离为0.2-2毫米。
4. 施加脉冲电场：在电转染过程中，施加一个短暂的高电压脉冲（通常为50-1500伏特），使细胞和转染基质之间产生电压差。
这个脉冲电场的作用是在细胞膜上形成孔隙，使外源DNA或RNA能够通过电荷间的相互作用直接进入细胞质。
5. 转染后的细胞处理：将细胞转移到培养基中，让其进行恢复和增殖。
此时，转染的DNA或RNA已经进入细胞质，并被细胞的基因表达系统识别和转录。
电转染原理的关键是脉冲电场的作用，它可以在短时间内创建一个临时微孔，使外源DNA或RNA通过穿越细胞膜，进入到细胞质中。
脉冲电场作用于细胞膜时，会产生电荷的电力作用，使细胞膜上的脂质疏水层分子破裂，形成通道，从而使DNA或RNA分子能够通过这些通道进入细胞内。
整个电转染过程通常在数毫秒到几十毫秒内完成，具有高效、可大规模转染、对不同类型的细胞适用等优点，因此在基因转染研究、基因治疗、基因工程等领域被广泛应用。
原代细胞电转染
原代细胞电转染
原代细胞电转染是一种常用的转染方法，具有转染效率高、毒性低、方法简单、省时省力等优点。
但需要注意的是，原代细胞转染难度较大，因为不同类别的真核细胞具有不同的生长状态、细胞大小和细胞膜结构，所以转染参数以及可获得的最大转染率也不尽相同。
电穿孔转染不同的细胞需进行个别优化选择，获得的最优转染参数也显著不同。
以下是原代细胞电转染的一般步骤：
1. 细胞接种：在转染前一天接种细胞，使细胞在转染时密度在30%\~50%。
2. 准备转染溶液：将目的基因和载体用无血清培养基稀释。
3. 混合：将目的基因和载体混合，室温孵育5\~10分钟。
4. 电穿孔：将混合物加入培养的细胞内，进行电穿孔。
5. 培养：将电穿孔后的细胞放入培养箱中培养，检测基因表达效果。
需要注意的是，电穿孔转染需要使用特定的仪器和试剂，操作时应遵循厂家提供的操作说明。
此外，不同的细胞类型和目的基因可能需要不同的电穿孔参数和培养条件，需要进行适当的调整和优化。
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电转染标准步骤
1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。
对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。
若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。
（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。
经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。