软脂酸钠法纯化牛血清白蛋白的工艺研究_何美霞

软脂酸钠加入量 1∶ 2 /3 1∶ 1
因素 水浴时间（ h）
1 1． 5
放置时间（ h） 1
1． 5
表 5 L4 （ 23） 正交试验和结果
试验号 软脂酸钠加入量 水浴时间（ h） 放置时间（ h） 提取率（ % ）
1
1
1
1
22． 4
2
1
2
2
15． 0
3
2
1
2
11． 3
4
2
2
1
28． 1
K1
37． 4
均方 40． 478 224． 865 105． 569 31． 538
注： 软脂酸钠温度各水平间比较 F = 224. 877； 血清稀释度比较 F = 1249. 248； 放置时间比较 F = 586. 492，均为 P ＜ 0. 05
表 4 影响 BSA 提取率的 3 因素 2 水平
水平 1 水平 2
* 基金项目： 河南省科技厅项目（ 072103810403）
积） 、血清加入水和软脂酸钠后放置时间（ 简称为放置时间） 及血清加入水和软脂酸钠后水浴时间（ 简称为水浴时间） 对 BSA 提取率（ 白蛋白总量 / 血清中蛋白总量 × 100% ） 的影响， 确定 BSA 纯化的工艺参数，并对产品做初步质量分析。1） 首先固定水浴时间为 1 h，采用 L9（ 34） 正交设计［5］，观察软 脂酸钠加入时的温度、血清稀释度、放置时间和软脂酸钠加 入量对 BSA 提取率的影响。在以上纯化条件确定后，水浴时 间分别设定为 1 、1. 5 、2 h，确定最佳水浴时间，然后血清稀 释度分别设定为 1∶ 1、1∶ 1. 5、1∶ 2，进一步确定血清稀释度对 提取率的影响。2） 通过 L4 （ 23） 正交设计，对影响较大的因 素做再次筛选，并验证以上各步试验结果，从而确定最终纯 化条件。 1. 5 产品质量分析 1 ） 外观； 2 ） 含水量： 真空减压干燥 法［6］； 3） pH 值： 白蛋白经无菌无热原去离子水稀释，浓度为 10 g / L，pH 计 测 定； 4 ） 电 泳 分 析： SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳［7］； 5） 紫外扫描图谱（ 白蛋白和白蛋白标准品经无菌无热 原去离子水稀释，浓度为 0. 5 g / L） ［8］； 6） 白蛋白含量测定： 紫 外吸收法［9］。 1. 6 统计学方法 利用 SPSS17. 0 进行多因素方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
血清中的蛋白质主要是由 BSA 和球蛋白组成。软脂酸 钠与 BSA 结合使得后者可以对抗一定温度的变性。软脂酸 钠不仅能保护 BSA，而且对球蛋白具有沉淀作用。为了保证 BSA 的纯度和产量，必须严格控制提制过程的条件。
我们考察的 5 个实验因素分别为软脂酸钠加入时的温 度和加入量、血清稀释度、血清加入水和软脂酸钠后放置时 间及血清加入水和软脂酸钠后水浴时间。
表 1 影响 BSA 提取率的 4 因素 3 水平
软脂酸钠温度（ ℃）
水平 1
70
水平 2
67
水平 3
65
因素
血清稀释度 放置时间（ h） 软脂酸钠加入量
不加
不放置
1∶ 1
1∶ 1 /2
0． 5
1∶ 2 /3
1∶ 1
1
1∶ 1 /2
表 2 L9 （ 34） 正交试验和结果
试验号
软脂酸钠置时间 软脂酸钠
（ h）
加入量
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
K1
69． 2
33． 9
52． 8
48． 5
K2
48． 4
60
45． 7
65． 6
K3
60． 1
83． 8
79． 2
63． 5
R
20． 8
49． 9
33． 5
17． 1
·452·
·实验研究·
中国输血杂志 2012 年 5 月第 25 卷第 5 期 Chin J Blood Transfusion May，2012，Vol． 25，No． 5
软脂酸钠法纯化牛血清白蛋白的工艺研究*
何美霞1 张勇1，2 阚全程3 朱建立1 张卫茹4 华海婴1 杜斌2 贺石林5 （ 1. 郑州大学 医药科学研究院 药理研究室，河南 郑州 450052； 2. 郑州大学 药学院； 3. 郑州大学 第一附属医院 药学部；
K2
39． 4
R
2
33． 7 43． 1 9． 4
50． 5 26． 3 24． 2
表 6 L4 （ 23） 正交试验结果方差分析
软脂酸钠加入量
离差平方和 2． 066
自由度 1
均方 2． 066
水浴时间
28． 858
1
28． 858
放置时间
158． 458
1
158． 458
注： 放置时间比较 F = 187. 524，P ＜ 0. 05
提取率 （ %） 8． 9 20． 9 39． 4 4． 6 19． 5 24． 3 20． 4 19． 6 20． 1
表 3 L9（ 34） 正交试验结果方差分析
软脂酸钠温度 血清稀释度 放置时间
软脂酸钠加入量
离差平方和 80． 956 449． 729 211． 137 63． 077
自由度 2 2 2 2
图 1 白蛋白 SDS-PAGE 电泳图
图 2 BSA 紫外扫描图
3 讨论
常规纯化 BSA 的方法多采用 3. 8% 枸橼酸钠抗凝血得 到血浆。而本工艺采用血清，避免加入抗凝剂，既节约成本， 也可减少化学原料的掺入，提高了白蛋白纯度。
与以往的工 艺 加 入 辛 酸 钠 作 为 蛋 白 稳 定 剂 不 同［10］，该 研究使用软脂酸钠代替辛酸钠，软脂酸钠为十六烷酸盐，而 辛酸钠为八烷 酸 盐，故 前 者 结 合 白 蛋 白 的 能 力 更 强［11］。 据 报道，软脂酸对 BSA 热处理具有保护作用［12 ～ 14］。且纯化过 程中不再加 入 乙 醇 等 有 机 溶 剂，避 免 了 蛋 白 发 生 聚 集 或 变 性，同时 可 减 少 对 环 境 的 污 染 和 生 产 过 程 中 的 不 安 全 因 素［1］。软脂酸钠 价 格 也 较 辛 酸 钠 低 廉，可 有 效 降 低 生 产 成 本。该方法有利于缩短白蛋白的制备时间，减少产品处理环 节，提高蛋白收率。
4. 中南大学 湘雅医院 肾脏内科； 5. 中南大学 湘雅医学院 生理学系）
摘要： 目的 研究软脂酸钠法纯化牛血清白蛋白的最佳工艺。方法 以牛血清白蛋白提取率为考察指标，通 过正交试验和单因素试验，研究软脂酸钠加入时的温度和加入量、血清稀释度、放置时间及水浴时间对白蛋白提取 率的影响，并分析产品质量。结果 该工艺白蛋白提取率达 41. 1% ，白蛋白含量达 95. 0% 以上。血清稀释度对白 蛋白提取率影响大，放置时间次之。该法纯化牛血清白蛋白的条件为软脂酸钠加入时的温度为 70℃ 、加入量 1∶ 2 / 3，血清稀释度为 1∶ 1，放置时间为 1 h，水浴时间为 1. 5 h。结论 该工艺是实现高效、快速纯化牛血清白蛋白的有 效方法。
关键词： 牛血清白蛋白； 软脂酸钠； 纯化 中图分类号： R457. 1 R575. 5 文献标识码： A 文章编号： 1004-549X（ 2012） 05-0452-03
牛血清白蛋白（ bovine serum albumin，BSA） 是血清中含 量最丰富的蛋白质，约占总量的 60 % ，在生化试验、遗传工 程和医药研究中有着广泛的应用。国内 BSA 的纯化多沿用 人血白蛋白的生产工艺，采用硫酸铵盐析法、低温乙醇沉淀 法和利凡诺法等常规手段［1 ～ 3］。本文探讨了 1 种纯化 BSA 的新工艺—软脂 酸 钠 法，并 通 过 正 交 设 计 确 定 最 终 工 艺 参 数，以期为 BSA 的纯化提供有益参考。
试验过程中，我 们 首 先 进 行 了 正 交 试 验，利 用 极 差 分 析 和方差分析，在水浴时间为 1 h 的条件下，以软脂酸钠加入时 的温度、血清稀释度、放置时间和软脂酸钠加入量为考察因 素，通过 L9 （ 34） 正交试验筛选合适的纯化条件，观察其对 BSA 提取率的影响，得到初步的提取条件，即影响提取率的 主要因素此次为血清稀释度、放置时间和软脂酸钠温度。随 后在确定软脂酸钠加入时的温度为 70℃ 、血清稀释度为 1 ∶ 1、放置时间为 1 h 和软脂酸钠加入量为 1∶ 2 /3 的条件下，筛 选了水浴时间。在此基础上，又对影响提取率较大的血清稀
中国输血杂志 2012 年 5 月第 25 卷第 5 期 Chin J Blood Transfusion May，2012，Vol． 25，No． 5
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图像见图 1，紫外扫描图谱见图 2。标准品与产品最大吸收 峰均在 280 nm 附近。该方法白蛋白提取率大于 41. 0% ，白 蛋白含量 ＞ 95. 0% 。
2 结果
2. 1 观察 L9（ 34） 正交试验对 BSA 提取率的影响 见表 1 ～ 3。 2. 2 通过正交设计筛选最终条件 放置时间也是 1 个重要 影响因素。通过最终的 L4 （ 23） 正交试验［5］，在软脂酸钠加 入时温度为 70℃ 、血清稀释度为 1∶ 1的条件下，以软脂酸钠 加入量、水浴时间和放置时间为考察因素，最终确定纯化条 件，并对以上各步试验结果进行验证 见表 4 ～ 6。 2. 3 产品质量分析 本法提取的 BSA，冻干后为白色疏松 固体，无融化现象； 复溶后为淡黄色澄明液体，无浑浊，水溶 性大于 8. 0% ，含水量 ＜ 0. 3% ，pH 7. 3 ～ 7. 4，分子量及电泳