牛血清白蛋白的提取与鉴定 自主设计实验

自主实验设计

牛血清中白蛋白的提取与鉴定

小组成员：

【目的】

1.通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、电泳、及呈

色反应的原理及应用。

2.通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的

基础。

【原理】

本实验用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、纯化及鉴定牛血清白蛋白。首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。第二步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。第三步利用电泳将蛋白彻底分离。最后，将其与标准膜一起染色，漂洗，进行对比即可达到鉴定的目的。

【操作】

1盐析

取小牛血清0.5ml+PBS液0.5ml+饱和硫酸铵2.3ml，充分混合均匀，静置20min，2500r/min 离心10min。

2、透析

取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入有自来水的小烧杯中透析，要不断震动，每隔2min换一次水，换15次。放入试管待用。

3、准备与电泳

1）取两条2.5cm x 8.0cm 的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。

2）将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的光泽面距一端1.5cm处作为点样线，并用铅笔在上面编好号①②。

3）用两个点样器分别在标准液和测定液中櫵一下，点样器下端粘上薄层标准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。

4）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时点样面向下（无光泽面），点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡5min后，即可通电。调节电泳仪，使两极间距的电压为15v/cm，电流0.4~0.6Ma/cm 膜条，通电50分钟关闭电源。

5)通电完毕后，用镊子取出膜条，直接浸于盛有氨基黑10B的染色

液中，染2min取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液中各漂洗5min，直至背景漂净为止。用干滤纸吸干薄膜。

6）观察两张薄膜的颜色。

【实验材料】

1.器材

电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内有两个电极（用铂丝制成）。

培养皿、试管、醋酸纤维素薄膜2张、玻璃纸1张、烧杯、离心机

2.试剂

①PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，phosphate buffer saline）用

0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.2）配制撑的0.9%NaCl溶液。

②PH=7.2饱和硫酸铵溶液用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调到pH7.2。

③氨基黑10B的染色液：

④巴比妥缓冲液，pH8.6，离子强度0.6：

⑤漂洗液：

⑥牛血清及标准白蛋白样液。

【参考书目】

*《生物化学实验》——上海交通大学出版社，2005版

*《生物化学实验》——中国医药科技出版社，2007版

*《生物化学实验教程》——军事医学科学出版社，2004版

*《生物化学与分子生物学实验教程》——第四拘役大学出版社，2010版