胚胎工程技术

1200平方米SPF级别的高级实验动物中心
A
A：动物中心每间饲养房都有独 立的控制系统； B：具有独立通风排气特点的IVC 笼具； C：无菌饮用水供应系统
B
C
SPF级别的高级实验动物中心－鼠房
共聚焦显微镜 LSM780
高速高通量基因分析仪 MiSeq
电动显微操作仪 TransferMan NK2
哺乳动物中的人工受精和胚胎切割
人工受精：如 主要用于治疗不 育症、保存 和运 输优良个体。
胚胎切割：在 2－4细胞期分割 胚胎细胞，用于 繁殖优良家畜个 体。
1978年，全世界第一位试管婴儿 路易斯布朗在英国诞生。
第一代试管婴儿——IVF-ET 体外受精
第二代试管婴儿—卵浆内单精子注射(ICSI) 1992年比利时
Shinya Yamanaka山中伸弥
通过令高度分化的体细胞接受外来刺激，可以使细胞回到类似于“干细胞”的状 态，研究人员将这一细胞称为“刺激触发性多能性获得细胞”，英文名 StimulusTriggered Acquisition of Pluripotency cells，缩写为STAP细胞。
小保方晴子
理化学研究所 笹井芳树
转基因小鼠技术
What？
将经过修饰的外源基因导入小鼠体内，表达突变的性状且可 遗传给子代。
Why?
通过基因修饰小鼠，既深入研究目的基因在胚胎发育中的作 用，探讨其机制，也可建立疾病动物模型，明确疾病发生机 理，有助于疾病的早期诊断及治疗药物的开发。
How?
DNA原核显微注射、ES细胞囊胚显微注射
提取小鼠基因组DNA进行鉴定
Any questions?
胚胎移植技术的发展
粗线期初 级精母细 胞 连接复合体 基膜
类肌细胞 B型精原细胞
A型精原细胞
B型精原细胞 初级精母细胞 次级精母细胞
.精子细胞
2.10 精子发生过 程
.精子.
精子的形成
1.核的变化: 染色质的浓缩和核形状的改变
2.细胞器的变化: 顶体的形成: 由高尔基体形成 轴丝的形成: 近端中心粒和远端中心粒,微管蛋白形成轴丝
发生在羊膜形成后(约受精9天后) 的分割，共用绒毛膜和羊膜， 易出现连体儿。
6.26 连体双胎（伊朗，29岁）
6.27 连体双胎（埃及，婴儿）
四. 细胞核移植技术
非洲爪蟾的细胞核移植步骤（Gurdon,1962) 实验表明，发育越后期的胚胎，其细胞核的 发育潜能越小，
11.03 非洲爪蟾的细胞 核移植步骤 （Gurdon,1962) 实验表明，发育越后期
人的发育，从受精至植入
5.14 人的发育，从受精至Leabharlann Baidu入
哺乳动物胚泡的着床
胚泡在向子宫移动过程中体积 增大，是因为因为定位于滋胚层 细胞膜囊胚腔一侧的Na－K泵将 外部Na+泵入腔中，最后通过渗 透作用吸水使囊胚腔增大。
胚胎外的透明带阻止了胚泡与 输卵管壁的粘连。
胚泡到达子宫时，胚胎细胞分 泌strypsin（一种类胰蛋白酶)， 它使透明带穿孔，胚泡从孔中挤 出与子宫壁接触，通过一系列反 应而着床。
囊胚的收集
AM8:00 收集E3.5d的小鼠胚胎，此时的囊胚必须是恰好扩 展的较好，若过早，注射时很容易碰到内细胞团，若过度 则很难穿透
* E3.5d的囊胚应从孕鼠的子宫中取得
ES细胞囊胚显微注射
子宫内的胚胎移植
转基因小鼠的获得
通过显微注射获得嵌合小鼠，与相应的小鼠交配， 可获得所需基因突变小鼠。
一. 精子的发生
白膜 血管 小叶间隔
间质细胞
生精小管
生精小管
2.05 生精小管生精小管
2.07 生精小管
Sp：精子细胞；Sg：精原细胞；Sn：支持细胞；Sc：精母细胞；LP： 界膜；LC：间质细胞
2.08 生精小管
A型精原细胞
支持 细胞
A型精原细胞
2.09 生精小管结构模式
晚期精子细胞
早期精子细胞
顶体区域
赤道区
顶体后区
顶体 精子质膜
顶体 外膜
细胞核 顶体内膜
膜泡状化
顶体内膜改为 精子前端质膜
仓鼠精子的 顶体反应
精子质膜 顶体内外膜
精子质膜和顶体外膜的融合
中心粒
仓鼠精子的顶体反应
质膜
精子被雌性生殖道激活 精子结合于透明带
放射冠 透明带
顶体反应 精子在透明带上溶解出孔洞
精卵质膜融合
小鼠精子顶体反 应地点
多年来，干细胞的研究一直是一个美丽的梦想，是一 个关于“不死”和“永生”的梦想，这个梦想似乎逐 步成真。
至少可以毫不夸张地说：在细胞水平上做到了“返老 还童”。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2012
John Bertrand Gurdon约翰-格登
顶体囊
顶体
2.17 顶体的顶体的形成过程
头部
核 顶体
中段
尾部
主段
轴丝 末段
细胞膜 核
中心粒
线粒体
线粒体鞘 线粒体
外周致密纤维
纤维鞘
外周致 密纤维
哺乳动物精 子结构模式
线粒体鞘
外周致密纤维 线粒体
轴丝
2.32 精子尾部中段结构
第9,1,2外周
致密纤维
纤维鞘的环肋
轴丝的二联微管
纤维鞘 的纵柱
第4,5,6,7外周致密纤维
透明层
受精膜 透明层
海胆卵子的皮层反应
4.3雌6海雄海胆原胆受核染受精成精卵蓝卵中色，中雌小雌雄的雄原为雄原核原核的核的融，大融合的合为雌原核。微管染成绿色
雌雄原核染成蓝色，小的为雄原核，大的为雌原核。微管染成绿色
子宫
桑椹胚
2细胞期
透明带
输卵管 壶腹部
胚泡 植入的早期
卵巢 排卵
受精 输卵管伞
次级卵泡 成熟卵泡
黄体
闭锁卵泡
红体
卵巢结构模式
卵母 细胞
排出的卵母细胞
卵泡
髓质
皮质
卵巢组织结构
各级卵泡 结构模式
卵泡腔
颗粒细胞
放射冠 卵丘
3.33 次级卵泡
大鼠的成熟卵泡
卵母细胞 放射冠
3 排卵
哺乳类透明带 的形成
三. 受精
卵丘
卵子
受精
透明带
4.06 仓鼠的未受精卵
小鼠精子与透 明带的结合
的胚胎，其细胞核的发 育潜能越小，
11.01 Spemann结扎受精卵的实验(1938年） 实验说明，16细胞期的胚胎细胞核仍然具有发育的“全能性”。
玻璃针
去核卵
11.02 豹蛙的细胞核移植 （Briggs&king,1952)
供体细胞 33%
11.06 哺乳动物的核移植
11.07 显微操作仪
注射PMSG与注射hCG的时间间隔在42-48h内，能获得满 意的合子
载体构建
基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列 及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重 组效率的关键因素。
DNA原核显微注射
受精卵的收集
AM7:00 收集E0.5d小鼠合子 * E0.5d的合子应从孕鼠的输卵管的壶腹部中取得。 去除卵丘细胞获得注射用合子 * 挑选形态发育良好的合子，应具有两个明显原核，两个极体
➢超数排卵
技术路线
➢载体构建
➢受精卵的收集
➢DNA原核显微注射
➢输卵管内胚胎移植
➢转基因小鼠的获得
超数排卵
为了使获得足够数量显微注射用合子的劳动和成本降到最 低，绝大多数情况下都使用超数排卵生产合子。
诱导超数排卵，一般用孕马血清促性腺激素（PMSG）模 仿内源性促卵泡激素（FSH）促进卵子成熟，用人绒毛膜 促性腺激素(hCG)模仿促黄体素（LH）诱导排卵
精子尾部主段结构
2.34 精子尾部主段
2.33 轴丝横切面
外动力蛋白臂
中央微管 质膜
二联微管
内动力蛋白臂
中段
颈段
末段
人的精子
主段
中段
卵原细胞增殖
发育成原始卵泡
卵原细胞生长
初级卵 母细胞
雌雄原 核融合
第二次成熟分裂
二. 卵子的发生
核移向表面 第一次成熟分裂 第一极体
精子入卵
第二极体
哺乳动物的卵子发生
两次的停顿：
1. 停留在第一次成熟分裂前期的双线期---孕酮等 激素导致细胞核分裂，第一次成熟分裂的结束。
2. 停顿在第二次成熟分裂的中期，此时的卵母细胞 出现细胞静止因子的物质，维持细胞周期蛋白，使 其无法分裂。
精子入卵后，钙离子的增多，钙调蛋白使细胞静 止因子分解，完成了第二次减数分裂。
次级卵泡 闭锁卵泡 晚期初级卵泡 早期初级卵泡 卵 巢 系 膜
线粒体鞘的形成: 线粒体部分参与精子的结构,哺乳动物精子细胞线粒体伸
长,移位到轴丝周围,有规律地缠在轴丝的外方,形成线粒体 鞘
其余细胞质的变化: 大部分的细胞质被抛弃
鞭毛
中心粒
顶体囊 顶体
纤维鞘 终环 线粒体鞘
精 子 的 形 成 过 程
2.14 精子形成过程
高尔基体 细胞核 顶体囊
高尔基体 顶体颗粒
G.海胆双精受精后的第一次 卵裂的中期，微管染色为绿 色，DNA为黄色；H.人双精 受精后的第一次卵裂，中心
粒染色为黄色，微管染色为 红色，染色体为蓝色。
海胆双精子入卵的结果
海胆卵受精前后的膜电位变化
精子入卵前的卵子表面
精子入卵，皮层颗粒 释放，卵黄膜升起
卵黄膜
微绒毛
质膜
受精膜形成
皮层颗粒
透明层形成
小鼠的核移植
11.12 克隆羊多莉
黄禹锡
《克隆的回归》
Sooam研究组
诱导性多潜能干细胞
将四个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞， 进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称 之为“诱导性多潜能干细胞”（induced pluripotent stem cells, iPS细胞）。这一研究明确 地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源 导入而被重编程到具有多能性的状态，因而受到了 整个生命科学领域的广泛关注。
技术路线
➢胚胎干细胞的制备 ➢囊胚的收集 ➢ES细胞囊胚显微注射 ➢子宫内胚胎移植 ➢转基因小鼠的获得
ES细胞系的获得
向已经建立和分析过ES细胞系特征的实验室索取 从商业细胞库购买ES细胞 从囊胚期的胚胎自己建立ES细胞系
注射用ES细胞的制备
ES细胞的复苏、培养、冻存 ES细胞的电转化及筛选
DNA原核显微注射
输卵管内的胚胎移植
转基因小鼠的获得
通过显微注射获得基因突变小鼠 转基因小鼠的鉴定
1）小鼠基因组DNA的提取 2）PCR鉴定
ES细胞囊胚显微注射法
技术原理
通过基因打靶的方式将目的基因导入ES细胞，将打靶基因 成功导入的ES细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠， 这样获得的小鼠有的组织来源于ES细胞，有些组织来源于 囊胚。将获得的嵌合体小鼠和野生型小鼠交配，以确定嵌 合体小鼠的生殖系传递能力，一般情况下，大约有一半左 右的嵌合体小鼠具有生殖系传递能力。
绒毛膜 板中的 血管
脐动脉（2条） 绒毛干
胎盘隔
6.21 胎盘
细胞滋养层壳 底蜕 膜静 脉
螺旋动脉 子宫肌层 底蜕膜
人类的同卵双生的发生(占出生总数的0.25%)
发生在滋胚层形成前(约受精后5 天前)的分割，有独立的绒毛膜 和羊膜。占同卵双生的33%。
发生在滋胚层形成后但羊膜形 成前(约受精后5－9天)的分割， 共用绒毛膜，有独立的羊膜。 占同卵双生的66%。
第三代试管婴儿—PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis) 植入前遗传学诊断
透明带 内细胞团 囊胚腔
滋养层
内细胞团
囊胚腔
哺乳动物的卵裂
卵黄囊
底蜕膜
脐带
包蜕膜 壁蜕膜
羊膜腔
子宫腔 胚外体腔
底蜕膜
绒毛
卵黄囊 丛密绒毛膜
平滑绒毛膜
6.17 子宫中的胚胎
羊膜
脐静脉（1条）
仓鼠精卵融合 的早期
精子的获能 哺乳动物的精子需要在雌性生殖道中停留 一个特定的时期,以获得对卵子授精的能力, 这一过程称为获能。
输卵管中的牛精子（精子获能）
精子质膜 顶体内外膜
精子质膜和顶体外膜的融合
中心粒
仓鼠精子的顶体反应
海胆精子入卵过程
精子中心粒
雄原核
雌原核 原核融合 第一次卵裂
细胞崩解， 胚胎死亡
手动显微操作仪CZ-MOM-202D 红外双色激光成像系统odysseyCLX
科研基础设施和大型科学仪器设备
6890N气相色谱仪
BX51荧光显微镜
激光共聚焦显微镜
Real-time PCR仪
流式细胞仪
自动显微操作仪
手动显微注射仪
技术原理
将外源修饰的DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，外源DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗 传给后代。注射发生在哺乳动物受精卵发育前期，即两个 原核时期，这两个原核分别来自于卵母细胞和精子，随后 这两个原核将发生融合，注射的DNA整合到染色体中。