生化检测方法汇总

一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法

器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清试剂:

（1）0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液：

①0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶

解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。

②0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml,

4℃保存。

③将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即

为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。

（2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）：

取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。（3）SGPT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) :

取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。

（4）GOT底物液(DL–天冬氨酸200mmol/L ,α-酮戊二酸2mmol/L):称取α- 酮戊二酸29.2mg 和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至

7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱保存。（5）2.4-二硝基苯肼溶液:

取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/L NaOH溶液:

称取16g固体NaOH，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL，备用。

每个样做3个平行，置37水浴30分钟，各管加2，4-二硝基苯肼液0.5mL，混匀，再在37℃水浴中放置20mL，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸光值均减去空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。

对照及样品各做3个平行，充分摇匀，静置10分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力。

●谷丙转氨酶活性单位：

37℃，pH7.4，每小时每毫升血清催化生成1μmol 丙酮酸为1个单位。例：0.1ml 血清每小时催化生成0.1μmol丙酮酸, 即相当于GPT 100U / 100ml 血清。

●注意：

1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中

保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。

2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过

500U时，需将样品稀释。

3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无

作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸

价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。

4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，

会影响测定效果。

5. 血清样品的测定需在显色后30分钟完成。

6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸后易

变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不

易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。

7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有

超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。

8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本

可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管

优点：尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他比色法准确.故卫生部临检中心建议国无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法.1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理, 缺点：由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足,反应速度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应后,新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大.

* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm

的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。

* 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1

个活性单位，即1IU=1umol/min。

* King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生

成1μmol丙酮酸称为一个单位。

* Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用

30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。

二、尿素氮（BUN）（二乙酰一肟法尿素测定）

（一）仪器设备：水浴锅、紫外分光光度计、10mL试管

（二）试剂：

1、尿素氮试剂：蒸馏水100mL，浓硫酸44mL，85%磷酸66mL，冷却至室温后，加氨基硫脲

50mg，硫酸镉（3CdSO4·8H2O）2g，溶解后稀释至1000mL。

2、20g/L二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g，加入蒸馏水溶解，定容至

1000mL。

3、尿素氮标准贮存液（357mmol/L）：称取尿素1.072g溶解于蒸馏水中定容至

1000mL，至于棕色瓶中贮存。

4、尿素氮标准应用液（17.85mmol/L）：取贮存液5mL，加蒸馏水定容至100mL。（三）操作步骤

按下面表格的试剂配比操作：