PI staining FACS

PI staining

实验目的：检测带有不同目的片段的相应质粒分别电转进HepG2后，细胞生长周期的变化情况（电转48 h后分析）

实验材料：带有不同质粒的HepG2，PI/RNase Staining Buffer（BD, Cat No: 550825，贮存于4℃），-20℃75%乙醇，2% Triton X-100

实验步骤：

1.收集细胞培养皿中的medium，即上清a；

2.用适量PBS slightly rinse细胞层并收集PBS，即上清b；

3.Trypsin消化培养皿中的细胞，所得单细胞悬液c；

4.最后用适量PBS rinse dish并收集，即上清d；

5.500g离心3-5分钟，收集a+b+c+d细胞；

6.倒掉上清，加入适量PBS，V otex mixture上重悬细胞并500g离心3-5分钟，（此步骤之

后的实验可不用在超净台操作），弃上清，并在吸水纸上倒扣，尽量将上清去除干净；

7.在vortex mixer涡旋，使得细胞尽量处于均一的悬液态，然后在不断振荡的情况下滴入

800 µL 75% -20℃冰乙醇固定（注：振荡器上前10滴缓慢滴入！！），然后置于-20℃固定至少2hr或者过夜。

8.500g离心3-5分钟，尽量将上清倒干净；

9.用1 mL PBS洗1遍，500g离心3-5分钟，倒掉上清；

10.加入200-400 µL RNase（20 µg/mL），PI（50 µg/mL），Triton X-100（0.2%），1xPBS，37℃

水浴0.5hr。500g离心3-5分钟，倒掉上清；本次实验使用BD的PI/RNase Staining Buffer 作为固定液，同时加入终浓度为0.2%的Triton X-100（母液为2%，PBS稀释）

11.800 µL PBS洗1遍；500g离心3-5分钟，倒掉上清；

12.用适量PBS重悬PI staining后的细胞；

13.Flow 分析；

14.500g离心3-5分钟，弃上清，4%多聚甲醛/1xPBS ，4℃固定一周内分析。

实验结果：