双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析共48页
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18
二、序列比对分析
1. 相似性与同源性 • 相似性(similarity)：
是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A 序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量 化的关系。当然可进行自身局部比较。
19
• 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白
6
7
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称 为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚 合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替 dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能 继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是 到A就终止了。
自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双脱 氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。
13
ห้องสมุดไป่ตู้动化测序原理
自动化测序类似于PCR反应， 但只用一条引物，反应混合物中 含有不同荧光标记的ddNTP与4 种dNTP。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色,而简化为由 1个泳道同时判读4种碱基。产物 条带经过检测仪时给出特定信号， 由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板； 模板用量少，不必克隆；可实现 高通量自动化。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
15
荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
16
17
Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： • 手工测序：最大约300 bp； • 自动测序：最大约1200 bp。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
2
基本原理：
✓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子；
✓ 利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和ddNTP的特性， 使ddNTP参入到寡核苷酸链 的3’-末端。因为ddNTP 3’不 是-OH，不能与下一个核苷 酸聚合延伸，从而终止DNA 链的增长。
1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 10
制得的四组混合物 全部平行地点加在变 性聚丙烯酸受凝胶电 泳板上进行电泳，每 组制品中的各个组分 将按其链长的不同得 到分离，从而制得相 应的放射性自显影图 谱。从所得图谱即可 直接读得DNA的碱基 序列。
14
由激光发射器产生的激 光束，通过精密的光学系统 后被导向凝胶表面的检测区。 在此，激光束垂直射向凝胶， 同经过检测孔的DNA片段发 生作用，并提供能量激发荧 光发色基团发射出具特异性 波长的荧光。这些荧光通过 聚焦镜集中后传给滤光镜/ 棱镜组件，以便四种碱基产 生的不同标记波长区别开来。 经成像透像最后由高灵敏度 的相机分段收集信号，传送 给计算所分析处理。
正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相 似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等 价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源 性为80％一说。
21
序列相似性比较： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库
进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就 是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成 这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用 的程序包有BLAST、FASTA等；
22
序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，
但来自不同物种的序列中进行多序列同时比 较，以确定该序列与其它序列间的同源性大 小。这是理论分析方法中最关键的一步。完 成这一工作必须使用多序列比较算法。常用 的程序包有CLUSTAL等；
即可得到测序结果：为GATCCGAT
11
3、技术路线：
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
12
4、 高通量自动化测序
DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一 方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指 “读片过程”的自动化。
质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者 非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80 ％都是不科学的。
20
序列的相似性和序列的同源性有一定的关系， 一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序 列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似 性来推测序列是否同源。
8
同理第二个反应产生的都是以C结尾 的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反 应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列 了.
9
假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C 三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产 生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是 ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以 继续延伸, 产生GATCCGAT.
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列
拼接和分析
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
二、序列比对分析
1. 相似性与同源性 • 相似性(similarity)：
是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A 序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量 化的关系。当然可进行自身局部比较。
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• 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称 为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚 合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替 dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能 继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是 到A就终止了。
自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双脱 氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。
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ห้องสมุดไป่ตู้动化测序原理
自动化测序类似于PCR反应， 但只用一条引物，反应混合物中 含有不同荧光标记的ddNTP与4 种dNTP。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色,而简化为由 1个泳道同时判读4种碱基。产物 条带经过检测仪时给出特定信号， 由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板； 模板用量少，不必克隆；可实现 高通量自动化。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
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Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： • 手工测序：最大约300 bp； • 自动测序：最大约1200 bp。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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基本原理：
✓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子；
✓ 利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和ddNTP的特性， 使ddNTP参入到寡核苷酸链 的3’-末端。因为ddNTP 3’不 是-OH，不能与下一个核苷 酸聚合延伸，从而终止DNA 链的增长。
1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 10
制得的四组混合物 全部平行地点加在变 性聚丙烯酸受凝胶电 泳板上进行电泳，每 组制品中的各个组分 将按其链长的不同得 到分离，从而制得相 应的放射性自显影图 谱。从所得图谱即可 直接读得DNA的碱基 序列。
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由激光发射器产生的激 光束，通过精密的光学系统 后被导向凝胶表面的检测区。 在此，激光束垂直射向凝胶， 同经过检测孔的DNA片段发 生作用，并提供能量激发荧 光发色基团发射出具特异性 波长的荧光。这些荧光通过 聚焦镜集中后传给滤光镜/ 棱镜组件，以便四种碱基产 生的不同标记波长区别开来。 经成像透像最后由高灵敏度 的相机分段收集信号，传送 给计算所分析处理。
正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相 似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等 价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源 性为80％一说。
21
序列相似性比较： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库
进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就 是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成 这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用 的程序包有BLAST、FASTA等；
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序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，
但来自不同物种的序列中进行多序列同时比 较，以确定该序列与其它序列间的同源性大 小。这是理论分析方法中最关键的一步。完 成这一工作必须使用多序列比较算法。常用 的程序包有CLUSTAL等；
即可得到测序结果：为GATCCGAT
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3、技术路线：
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
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4、 高通量自动化测序
DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一 方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指 “读片过程”的自动化。
质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者 非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80 ％都是不科学的。
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序列的相似性和序列的同源性有一定的关系， 一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序 列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似 性来推测序列是否同源。
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同理第二个反应产生的都是以C结尾 的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反 应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列 了.
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假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C 三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产 生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是 ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以 继续延伸, 产生GATCCGAT.
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列
拼接和分析
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。