16SrDNA 实验原理

一、 实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16SrDNA 序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5SrRNA 、16SrRNA 、23SrRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。16SrRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16SrDNA 。5SrRNA 虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp ，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA 含有的核苷酸数几乎是16SrRNA 的两倍，分子量太大，分析较困难。而16SrRNA 相对分子量在2kb 左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16SrDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：

DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 。

二、主要器具及试剂

PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（）

三、操作方法

1.细菌基因组总DNA的提取

接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。

(1)菌体收集：取新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。

(2)辅助裂解：加100μg/mL溶菌酶50μL，37 ℃处理30min。

(3)裂解：向每管加入200mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。

(4)向每管加入66μL5mol/LNaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。

(5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris-饱和酚，充分混匀，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质。

(6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000r/min离心3min，去除苯酚。

(7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000r/min离心15min，弃上清。

(8)用400μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。

(9)室温干燥后，用40μL1×TE溶解DNA。

(10)%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

(11)提取的基因组总DNA-40 ℃冰箱保存备用。

扩增细菌的16SrDNA

(1)16SrDNA的PCR引物：采用细菌的通用引物27F和1492R

(2)PCR反应体系为（20μL）：灭菌蒸馏水μL，

10×buffer2μL，

10mmol/μL，

27F和1492R引物各4μL，

DNA模板μL，

μL。

(3)PCR反应条件：

93℃预变性5min、94 ℃变性18s、56 ℃退火15s、72 ℃延伸78s，循环30次，72 ℃延伸7min。

(4)%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

扩增目的片断的纯化

通过PCR扩增出大量的目的片段，经%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入的EP管中，用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA，操作按说明书进行，方法如下：

(1)加入700μL溶胶液，55 ℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，直至胶块全部溶解。

(2)将溶胶液转移至吸附柱中，12000r/min离心30s，重复一次，提高回收率。

(3)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心30s，倒掉废液，重复漂洗一次。12000r/min离心2min以完全去除漂洗液。

(4)将吸附柱移至一个干净的管中，向吸附柱膜中央加入40μL的洗脱缓冲液，12000r/min离心2min收集DNA。

(5)回收DNA用%琼脂糖凝胶电泳检测。

目的片断的克隆

PCR纯化产物与pMD18-T载体连接体系（10μL）：胶回收产物2μL，pMD18-T 载体1μL，SoulutionⅠ5μL，无菌去离子水2μL，16 ℃连接4h。

转化

(1)取50μ感受态细胞于冰中融化。

(2)将5μL连接产物加入到已融化的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴

30min。

(3)42 ℃保温90s。

(4)冰浴2~3min。

(5)加入450μL LB液体培养基，轻轻混匀，200r/min，37 ℃培养40min。

(6)取适量上述培养液均匀涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37 ℃培养过夜。

5.转化子的筛选和鉴定

（1）重组菌株的菌落PCR

通过蓝白斑筛选阳性转化子，用灭菌的枪头将白色菌落接种至4mLLB液体培养基中，200r/min，37 ℃培养4h。取菌液作为PCR模板。

PCR反应体系（20μL）：灭菌蒸馏水μL，10×PCRbuffer（含15mmol/LMgCl2）2μL，10mmol/μL，μmol/L的上游和下游引物各4μL，菌液2μL，5U/μμL。PCR 反应条件：93 ℃预变性5min、94 ℃变性18s、56 ℃退火15s、72 ℃延伸78s，循环30次，72 ℃延伸7min。%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

（2）重组质粒的核苷酸序列的测定

对经过鉴定含有目的片断的单克隆菌液加入甘油-40 ℃保存，同时将同一单克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，将测得的序列提交GenBank数据库，根据测序结果，用BLAST搜索软件在NCBI（）的GenBank 数据库中调出相似性较高的16SrDNA基因序列，用软件进行多序列比对，用Phylipwx软件包中的Seqboot，Dnapars和Consense进行同源性分析并构建系统发育树。

四、实验结果提交

鉴定菌株的序列与哪个种最匹配，并构建该菌株的系统进化树。