卫生部消毒技术规范-抗菌部分

抗菌测试方法抗菌测试前期准备1. 各种溶液的配置100ml液体培养基溶液：1.8g营养肉汤+100ml去离子水。

100ml固体培养基溶液：1.8g营养肉汤+1.5g琼脂粉+100ml去离子水。

100ml氯化钠溶液：1g氯化钠+100ml去离子水。

2. 高压灭菌为保证灭菌质量，高压灭菌时间适宜控制在20至30分钟之间。

3.乙醇消毒所有样品包括人手在进入超净工作台前，须用75%的乙醇彻底擦洗一遍。

4. 活化菌种用移液枪头挑取一个典型菌落，至于3ml液体培养基的试管中。

把试管放置于恒温培养箱中，37℃，培养24小时。

三种抗菌测试方法1．抑菌圈法取活化过的菌种100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。

取抗菌膜（直径5mm左右），把含有抗菌成分的一面紧紧地压于涂干的平板上。

把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。

抑菌圈法示意图。

大圆为平板，四个小圆中有三个为抗菌膜，另外一个为不含有抗菌成分作为空白对照的膜。

2．平板计数法取活化过的菌种30μl滴于含有30ml液体培养基的锥形瓶中，在恒温摇床中培养2.5至3小时（细菌数约至于108个/ml)。

从锥形瓶中取100μl菌液分别均匀涂于含有抗菌膜和空白对照膜上，放置于恒温培养箱中，培养10小时。

取生理盐水10ml把膜上的细菌冲洗下来，用振荡器使其充分均匀分散。

从生理盐水中取100μl用十倍稀释法逐步稀释至细菌数为10到100个/ml（此梯度为最小梯度）。

从十倍稀释法稀释过后的细菌数（最小梯度）往上推两个梯度，分别为103个/ml和104个/ml，从此三个梯度中取100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。

把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。

没有抗菌剂对照样按以上相同方法进行。

抗菌率计算：A为对照样的细菌数，B-为加有抗菌剂的细菌数。

3．吸光度法从活化过的菌种中取一定量的菌液分别滴于含有抗菌剂和不含有抗菌剂的液体培养基的锥形瓶中，使其在600nm波长的吸光度（OD600）在0.1～0.2。

把含有上述培养基的放于恒温震荡培养箱中37℃培养，每隔15分钟测一次OD600。

直至不含有抗菌剂的液体培养基（对照样）的OD600数值的增长随时间的延长而趋于平缓为止，实验方可结束。

OD600随时间的增加而基本不变或降低的所用的最低抗菌剂浓度即为最低抑菌浓度，即MIC※ 以下是卫生部消毒技术标准的相关详细方法和步骤卫生部消毒技术规范（2002年版）2.1.7 抗（抑）菌试验2.1.7.1 目的测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。

常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验, 可视情况选用。

2.1.7.2 抑菌环试验（抑菌圈试验）2.1.7.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。

试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。

本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

2.1.7.2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。

(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片,经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h, 保存备用)。

(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。

(4)微量移液器(5μl～50μl, 可调式)。

(5)游标卡尺。

(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.7.2.3 操作程序(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂, 取无菌并干燥的滤纸片。

每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 20μl, 然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置温箱(37℃) 中烤干, 或置室温下自然干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品, 可直接制成直径为 5mm, 厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。

(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片,每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本, 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。

(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。

每涂抹1次, 平板应转动 60°, 最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。

盖好平皿，置室温干燥 5min。

(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板,每个平板贴放4片试验样片, 1 片阴性对照样片, 共 5 片。

用无菌镊子取样片贴放于平板表面。

各样片中心之间相距 25mm以上, 与平板的周缘相距 15 mm 以上。

贴放好后，用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。

盖好平皿，置37℃温箱, 培养16h～18h 观察结果。

用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。

试验重复3次。

测量抑菌环时, 应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。

测量其直径应以抑菌环外沿为界。

2.1.7.2.4 评价规定(1)抑菌作用的判断:抑菌环直径大于 7mm 者, 判为有抑菌作用。

抑菌环直径小于或等于 7mm 者, 判为无抑菌作用。

(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者, 判为合格。

(3)阴性对照组应无抑菌环产生。

否则试验无效。

2.1.7.2.5 注意事项(1)每次试验均应设置阴性对照, 不可省略。

在报告中亦必须将对照组的结果列出。

(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。

浓度过低,接种菌量少,抑菌环常因之增大; 浓度过高, 接种量过多, 抑菌环则可减小。

(3)应保持琼脂浓度的准确性, 否则可影响抑菌环的大小。

(4)培养时间不得超过 18h。

培养过久, 部分细菌可恢复生长, 抑菌环变小。

(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。

故抑菌剂滤纸片应在试验当天制 备。

2.1.7.3 最小抑菌浓度测定试验2.1.7.3.1原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。

2.1.7.3.2 试验器材（1）菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229。

（2）MH琼脂将38gMH琼脂干粉培养基溶干1000ml水中，加热至沸腾溶解，然后121℃高压灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用，此培养基将用于对照试验。

（3）0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2（4）加样器（1μl～10μl）（5）45℃～50℃水浴恒温箱（6）吸管、试管、平皿（7）37℃培养箱2.1.7.3.3 操作步骤（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。

（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，置45℃～50℃水浴恒温备用。

（3）双倍浓度培养基配制：将76gMH琼脂干粉培养基溶于1000ml水中。

加热至沸腾溶解。

然后121℃压力蒸汽灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用。

此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。

（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。

将在45℃～50℃水浴中的双倍MH琼脂10ml，加进平皿内，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。

（5）用加样器取1μl～2μl（含菌量约为107cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm～8mm（每个点菌量约为为104cfu）。

（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。

（7）将接种后的平板放置35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。

2.1.7.3.4 评判规定菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。

单一菌落生长可忽略不计。

2.1.7.3.5 注意事项(1) 接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。

(2)为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。

2.1.11.7 产品杀菌性能、抑菌性能及其稳定性鉴定(1) 样品采集为使样品具有良好的代表性,应于同一批号三个运输包装中至少随机抽取20件最小销售包装样品，其中1/4留样，1/4做抑菌或杀菌性能测试，2/4做稳定性测试。

(2) 试验菌与菌液制备试验菌：细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）,大肠杆菌（8099或ATCC 25922）酵母菌：白色念珠菌(ATCC 10231)菌液制备：取菌株第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h～24h), 用5 mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）洗下菌苔,使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至所需浓度.(3) 杀菌性能测试方法该试验取样部位，根据被试产品生产者的说明而确定。

1) 中和剂鉴定试验：进行杀菌性能测试必须通过以下中和剂鉴定试验。

①试验分组第1组：染菌样片 + 5 ml PBS第2组：染菌样片 + 5 ml中和剂第3组：染菌对照片 + 5 ml中和剂第4组：样片 + 5 ml中和剂 + 染菌对照片第5组：染菌对照片 + 5 ml PBS第6组：稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养作为试验材料阴性对照。

②评价规定第1组无试验菌,或仅有极少数试验菌菌落生长；第2组有较第1组为多, 但较第3、4、5组为少的试验菌落生长, 并符合要求；第3,4,5组有相似量试验菌生长, 并在1×104 cfu/片～9×104cfu/片之间, 其组间菌落数误差率应不超过15 % ；第6组无菌生长；连续3次试验取得合格评价。

2）杀菌试验①操作步骤将试验菌24h斜面培养物用 PBS洗下，制成菌悬液（要求的浓度为：用100μl滴于对照样片上，回收菌数为1×104 cfu/片）～9×104cfu/片）。

取被试样片（2.0cm×3.0cm）和对照样片（与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片，分成4组置于4个灭菌平皿内。

取上述菌悬液，分别在每个被试样片和对照样片上滴加100μl，均匀涂布，开始计时，作用2 min、5 min、10 min、20 min, 用无菌镊分别将样片投入含5 mL相应中和剂的试管内，充分混匀,作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿，用凉至40ºC～45ºC 的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15 ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35ºC±2ºC培养48h（细菌）或72 h（酵母菌），作活菌菌落计数。