多肽蛋白质N-端序列分析
N端序列分析
N端序列分析Edman降解（埃德曼降解）法，是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）首先创立用于肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析的方法。
Edman降解法检测的原理非常简单，在碱性条件下反应，用异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, PITC）与待检测的蛋白质（多肽）的N-端氨基生成苯氨基硫甲酰（PTC）的衍生物，然后处理-关环-选择性切断肽链N-端，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。
接着用有机溶剂萃取衍生物，在酸的作用下，不稳定的衍生物转变为稳定的的乙内苯酰硫脲（PTH）衍生物，余下肽链中的酰胺键不受影响。
通过用HPLC或电泳法分析生成的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），可以鉴定出氨基酸类别。
重复氨基酸鉴定反应可以达到对N端氨基酸按照从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。
对于序列较长的蛋白质（多肽），还可以将样品先切成小的肽段，先对肽段序列分析，再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。
蛋白质N端测序流程。
Edman降解法用于N端测序的优点：1. PITC与所有氨基酸残基的反应产率和回收率高，因此副产物少，可通过色谱进行准确鉴定；2. 反应时间快，对于大多数氨基酸残基来说，30min耦合时间，5min切割反应时间即可；3. 反应后的肽链仍然是完整的，可用Edman降解法重复测定新生的N末端氨基酸。
Edman降解法用于N端测序需要注意的问题：1. 样品纯度需>90%，盐离子含量在50 mmol/L之内，不含SDS等变性剂，N端必须是均一的高纯样品；2. 10 Pmol 样品可以测定20 aa；3. 液体样品不能含有蛋白酶，建议尽早测试，防止时间太长容易降解；4. 转膜样品在转膜前不宜放置太久以防样品扩散，转膜后可密封保存3-6个月，建议使用Coomassie R-250进行染色，电泳缓存液建议使用CAPS buffer；5. 样品无信号峰是，建议蛋白进行N-端封闭；6. 建议整个反应过程中尽可能使用高纯buffer。
蛋白质n端测序原理
蛋白质n端测序原理
蛋白质N端测序是一种常用的方法，用于确定蛋白质的氨基酸组成和序列。
该方法的原理基于蛋白质N端的氨基酸序列独特性。
首先，需要将要测序的蛋白质通过一系列的分离和纯化步骤获得较高纯度的蛋白质样品。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或高效液相色谱等技术来实现。
接下来，将蛋白质样品进行水解，常见的方法是利用酶或酸来将蛋白质水解为一系列短肽。
常用的酶包括胰蛋白酶和氨基酸脱肽酶。
然后，水解产物中的短肽将通过逐步分离和纯化的方法，以便将它们分离为尽可能单一的肽段。
之后，这些肽段将通过质谱仪进行质谱分析。
在质谱分析中，肽段将被离子化并通过质谱仪中的引导电场进行加速。
在质谱仪的分析部分，质谱仪会根据肽段的质量和电荷比进行测量，并生成质谱图。
通过解读质谱图，可以确定肽段的氨基酸组成和序列。
在质谱图中，每个肽段将对应一个峰，其质量由质谱仪测得。
通过对这些质量峰进行识别和碎片质谱分析，可以获得蛋白质N端的氨基酸序列。
总之，蛋白质N端测序的原理是通过分离、水解、质谱分析
和解读质谱图，来确定蛋白质N端的氨基酸组成和序列。
该方法在蛋白质研究中具有重要的应用价值。
多肽n端为q -回复
多肽n端为q -回复多肽n端为q，是指多肽分子中的氨基酸序列的N-末端，其中以氨基酸q为起点。
多肽是由两个或更多氨基酸残基连接而成的生物大分子，广泛存在于细胞内外的生物体中。
多肽的序列决定了其所具有的生物学功能和结构性质。
本文将从多肽的合成、结构和功能等方面详细介绍多肽n端为q的相关内容。
首先，多肽的合成是研究多肽n端为q的基础。
多肽的合成是通过连接氨基酸残基的方式进行的。
常用的合成方法有固相合成和液相合成。
固相合成是将C-末端的氨基酸残基连接在固相上，然后通过一系列的反应和洗脱步骤，逐渐扩大多肽链的长度。
液相合成则是在溶液中进行多肽的合成反应，通过对溶液中的氨基酸和偶联试剂进行反应，逐渐形成多肽链。
多肽的结构与其生物学功能密切相关。
多肽的结构主要分为原生结构、一级结构、二级结构和三级结构。
原生结构指的是多肽在生物体内的天然形态，其结构可以通过高分辨率的技术如核磁共振等来确定。
一级结构是指多肽链上氨基酸残基的排列顺序，通过这个顺序可以确定多肽链的序列。
二级结构是指多肽链上氨基酸之间的氢键和其他非共价键的作用，包括α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构。
三级结构是指多肽链上各个氨基酸残基之间形成的空间结构，通常由二级结构的排列组合和其他非共价键的作用决定。
多肽的功能多种多样，与其结构密切相关。
多肽作为生物体内重要的信号分子，具有多样的生物学功能。
例如，神经肽在神经传递中发挥重要作用，如神经肽Y、神经肽P等参与了疼痛传导和食欲调节等功能。
激素多肽如胰岛素、生长激素等则参与了正常的代谢和生长发育过程。
抗菌肽如防御素则是机体免疫系统中一种抑制微生物生长的重要组成部分。
此外，还有一些多肽参与了细胞间的信号传导、细胞黏附等功能。
多肽n端为q所表示的特定序列，可能影响多肽的结构和功能。
每个氨基酸残基在多肽链中都有不同的性质，包括电荷、极性、大小和疏水性等。
因此，多肽n端为q可能会影响多肽的溶解性、稳定性和生物活性等特性。
蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析
第十章蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。
在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。
除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。
常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。
蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。
在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。
因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。
§10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。
§10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。
近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。
常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。
茚三酮在酸性（pH = 3 ~ 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）：(10.1)除了-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，-，-，-和-氨基酸比-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm ）。
n端测序和c端
百泰派克生物科技n端测序和c端蛋白质是由氨基酸脱水缩合组成的链状大分子化合物，含有两个游离的末端，即氨基端（N端）和羧基端（C端）。
蛋白质的C端和N端有着特殊的意义，研究表明蛋白质N端序列与蛋白质的寿命和亚细胞器定位等有密切关系；C端序列影响蛋白质和多肽的空间结构和生物功能。
蛋白质C端和N端测序研究有利于分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。
蛋白质的N末端指氨基（-NH2）端，是蛋白质合成的起始端。
蛋白质N末端测序就是对N-末端的氨基酸种类和排列顺序进行准确分析。
随着生命科学研究和测序技术的发展，蛋白质末端序列的分析方法也不断更新、进步。
目前，测定蛋白质或多肽N末端的方法主要有Sanger法、酶降解法、Edman法、二硝基氟苯法（FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）和基于质谱的方法，其中Edman法和质谱法在N末端序列分析中应用最广。
目前，C末端测序技术还不够成熟，常用的蛋白质C端测序方法主要有羧肽酶法、化学法和串联质谱法等。
羧肽酶法和化学法的策略是通过酶解法或化学试剂裂解法获得C端氨基酸，再结合液相色谱或质谱技术对氨基酸种类进行鉴定。
串联质谱法测定蛋白质 C端序列的原理是将蛋白质样品酶解、消化成肽段混合物，然后对肽段混合物进行串联质谱分析，通过一级质谱信息选择C端肽段离子进行二级质谱分析，再根据二级质谱数据结合相应软件和数据库计算蛋白质的C端氨基酸序列。
百泰派克生物科技提供基于质谱法和Edman降解法的蛋白质C端和N端测序一站式科研技术服务，用于蛋白或活性多肽C/N端序列分析，还可用于确认重组蛋白表达情况，如是否完整表达、表达过程是否发生断裂以及C/N端序列是否发生修饰等。
百泰派克生物科技还可根据需求提供定制化技术服务，欢迎免费咨询。
多肽氨基酸序列分析
百泰派克生物科技
多肽氨基酸序列分析
多肽的氨基酸序列分析就是对组成多肽的氨基酸种类、数量以及排列次序进行鉴定，也称为多肽测序，属于多肽一级结构鉴定的内容。
目前较常用的多肽氨基酸序列分析方法包括经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法以及新兴的质
谱法等。
Edman降解法主要是对多肽的N末端氨基酸序列进行分析，但是其对N末端封闭的
肽链无能为力。
此外，Edman降解法测序速度较慢、样品用量较大、样品纯度要求
很高，而且对发生修饰的氨基酸残基识别的准确性不高。
C末端测序法在寻找理想
的PITC化学探针方面仍面临着很大的困难。
在这种背景下，高分辨率（达fmol 级）、高准确性以及操作简便的质谱测序技术则备受青睐，质谱分析技术的灵敏度
及准确性与待测物的分子质量成负相关，分子量增大时检测结果的准确性明显降低，多肽的分子量相比蛋白质小得多，因此采用质谱进行多肽氨基酸序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC
纳升色谱，提供高效精准的蛋白/多肽氨基酸序列分析服务技术包裹，可对各种蛋
白/多肽样品的一级结构进行解析，包括多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
以及多肽链内或链间二硫键的位置和数目等，欢迎免费咨询。
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
• 引言 • 蛋白质和多肽的氨基酸组成 • 氨基酸序列分析方法 • 氨基酸序列分析的应用 • 氨基酸序列分析的挑战与展望
01
引言
蛋白质和多肽的定义
蛋白质
由氨基酸组成的大分子，是生命 活动中不可或缺的组成部分，具 有多种生物学功能。
多肽
由2-50个氨基酸组成的短链肽， 具有较低的分子量和稳定性，在 生物体内发挥着重要的生理作用 。
蛋白质相互作用研究
通过分析蛋白质之间的相互作用，可以了解蛋白质在细胞内的功能 和调控机制，为疾病治疗提供新思路。
蛋白质修饰研究
通过对蛋白质的修饰进行分析，可以了解蛋白质的修饰对蛋白质功 能的影响，为药物设计和治疗提供依据。
生物进化研究
物种进化关系研究
通过对不同物种的氨基酸序列进行分析，可以了解物种之间的进 化关系和亲缘关系。
02
蛋白质和多肽的氨基酸组成
常见氨基酸的种类和特性
甘氨酸（Gly）：最简单的氨基酸，无手性碳原 子，呈中性。
01
缬氨酸（Val）：支链氨基酸，呈中性。
03
02
丙氨酸（Ala）：含有三个碳原子的氨基酸， 呈中性。
04
亮氨酸（Leu）：支链氨基酸，呈中性。
异亮氨酸（Ile）：支链氨基酸，呈中性。
05
药物设计与优化
氨基酸序列分析在药物设计 与优化中发挥着关键作用。 通过对靶点蛋白或活性多肽 的氨基酸序列进行分析，可 以发现潜在的药物作用靶点 ，为新药研发提供有力支持 。
生物进化与物种 分类
氨基酸序列分析在生物进化 与物种分类中具有重要价值 。通过对不同物种的蛋白质 和多肽进行氨基酸序列比对 ，可以揭示物种之间的亲缘 关系和进化历程。
质谱法N端序列分析
质谱法N端序列分析质谱法N端序列分析是一种利用质谱技术高效、准确地测定蛋白质/多肽N端的氨基酸序列的方法。
由于其高灵敏度、高分辨率和高通量的优点，可用于分析复杂的蛋白质/多肽混合物，以及鉴定修饰、突变以及其他序列变异。
与传统的Edman降解法相比，质谱法具有更高的通量和灵敏度，能够分析更复杂的样品和较大的蛋白质。
基于高分辨质谱法的N端测序，样品经过SDS-PAGE分离目标蛋白后使用蛋白酶酶解，酶解后的产物用Q-Exactive系列质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行质谱分析，肽段在质谱中碎裂得到b、y离子的二级质谱图，通过图谱与蛋白理论氨基酸序列比对确定蛋白质的N端位置。
百泰派克生物科技BTP结合高效液相色谱仪和高分辨质谱，基于N端测序原理，建立了基于质谱法的N端序列分析平台，百泰派克生物科技通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证；为您提供高质量的质谱法N端序列分析服务，我们采用两种不同的蛋白酶切方式，产生两个长度不同的N端肽段，相互验证最终确定蛋白N端序列。
欢迎免费咨询，了解更多详情！质谱法N端序列分析两种酶切方式对比。
实验仪器高效液相色谱串联质谱仪：高效液相色谱仪-Easy-nLC 1200。
电喷雾-组合型离子阱Orbitrap 质谱仪-Q Exactive™ Hybrid。
Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。
技术优势基于高分辨质谱法的N端测序，可以通过高分辨率质谱分析N端封闭和翻译后修饰(PTMs)，从而确定蛋白质N端起点；对于复杂的蛋白，我司支持对复杂蛋白进行N端二甲基化标记，通过分析标记位置确定复杂蛋白样品中的多个蛋白的N端起点。
案例示意蛋白药物样品的N端氨基酸序列分析：Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后得到质谱数据，质谱数据经过与理论数据库匹配，得到和理论N端序列（HYAHVDCPGHADYVK）相符合的MS2图谱，图谱如下：N端序列二级质谱图。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质测序
图3肌红蛋白部分肽链的氨基酸图谱
3 蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪
蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪，简称蛋白质序列仪。仪器的结构
是非常复杂的，主要分三大部分，即供气系统、主机和计算机。供 气系统包括惰性气体储气瓶，电磁阀，气路管等，主机包括自动进 样系统，化学反应系统，氨基酸自动分析系统，计算机主要控制测 序过程和报告结果。基本结果如图4所示。
(2)Edman降解：蛋白质与PITC反应后, 通过高纯的液态
TFA降解，获得ATZ—氨基酸
(3)氯丁烷抽提：降解下来下的氨基酸残基经氯丁烷抽提,
转移至容积为1ml的转化器中
(4)转化：ATZ—氨基在10%TFA的作用下转化为PTH—氨
(3) 抽提：切下的氨基酸残基经氯丁烷抽提, 转移至容积
为1ml的转化器中
(4) 转化：ATZ—氨基在TFA的作用下转化为PTH-氨基酸
(5) 高效液相层析分离鉴定：PTH—氨基酸被输送到氨基酸分析仪
中, 采用HPLC 反相层析法分离 (6) N末端氨基酸确定：将从蛋白质N—末端断裂下来的PTH—氨基 在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是 什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N—末端氨基酸。
(1) 高效薄层层析分析法:
将PTH-氨基酸, 通过高效薄层层析(如聚酰胺薄膜层析)分离, 每一种
PTH—氨基酸在一定的展层剂的条件下，其迁移率是一定的，在薄 膜上的坐标的位置就可以确定。然后与标准的PTH—氨基酸在薄膜 上的坐标的位置比较, 便可知蛋白质N末端切下来的氨基酸。PTH— 氨基酸在268nm处有较强的吸收. 用紫外光照射, 即可在荧光屏上看
到, 通过电脑自动识别相对位置, 即可确定。
(2) 高效液相层析法
多肽蛋白质N-端序列分析
5
多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号：«报告编号» b) 实验方法
1) 液体样品处理： 加 40μl 甲醇到 Prosorb 装置的 PVDF 膜上，待滤过后；加入 40μl 0.1%TFA 溶液， 待滤过后；再加入供试品，供试品的量需大于 50pmol，滤过后；再分别加入 两次 600μl 0.1%TFA 进行滤过。将 Prosorb 放入已预热至 50℃的加热器中烘干， 用 PorSorb Punch(图 1)切下 PVDF 膜，上样。
10
多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号：«报告编号»
8. 结论
综上所述，供试品«供试品名称»(批号：«供试品批号»)的 N 端序列为：xxxx
11
多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号实验原理edman降解法是异硫氰酸苯酯pitc在弱碱tma条件下与蛋白质n端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽ptc蛋白质然后在无水强酸tfa条件下n端的第一个残基从完整的多肽蛋白链上以2苯氨基噻唑啉酮atzaa的形式裂解下来之后在稀酸25tfa条件下atzaa转化为更加稳定的苯基乙内酰硫脲衍生物即pth氨基酸如图1生成的pthaa输送至高效液相色谱中进行在线分析剩下的多肽蛋白供试品可反复进行上述处理依次生成各种pthaa经液相系统色谱柱分离可以确定被测多肽蛋白质供试品n端的氨基酸排列顺序
报告编号：«报告编号»
多肽蛋白质 N-端序列分析
供试品：«供试品名称»
上海中科新生命生物科技有限公司 2015 年 4 月 19 日
报告编号：«报告编号»
«供试品名称»的多肽蛋白质 N-端序列分析
供试品名称：«供试品名称» 供试品批号：«供试品批号» 委托单位：«委托单位» 检测人员： 核验人员： 技术服务部负责人：
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定
第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素
在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单 个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是 由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可 能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98 ％。因此，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰， 影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基 酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。 ①对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂 解效率将更低。 ②循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基 分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟 基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端—氨基。 ③另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-{{汀生物也会部分转化成其他产物，造 成产率的降低。 耦联试剂PITC本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质”。测序完 成 后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)和重复产 率 (repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量， 有时可以推测N端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而 重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有 过多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。
四、影响C端测序反应产率的因素 C端测序副反应较多，最高初始产率仅为20％，而对于Glu，Asp， Ser，Thr等氨基酸，其产率将更低。如C端富含上述几种氨基酸，测序 将十分困难。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐 反应成环，整个测序过程将终止。 到目前为止，C端测序可测1～10个残基，一次测序需要的量比N端测 序要大得多，至少需1nmol。 此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比N 端测序复杂，需要较多的经验。目前C端测序结果最好的一个样品是马 肌红蛋白原，可测C端10个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪 器的稳定性。 另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种ATH衍生物。 如Arg的ATH衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATH可被乙酰化；Cys 被修饰后将形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脱氢Ala-ATH；脱水ThrATH将产生两个非对映异构体。
生化分析题及计算题
生化分析题及计算题（一）多肽序列分析1.测定一种细菌七肽的氨基酸顺序。
经分析，它的氨基酸组成是：Lys1、Pro1、Arg1、Phe1、Ala1、Tyr1和Ser1。
在胰凝乳蛋白酶作用前，此肽不与FDNB反应。
经胰凝乳蛋白酶作用后，此肽水解为2个肽A和B，A肽的氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser，B肽为Phe、Lys、Arg、Pro。
A肽和B肽分别与FDNB反应产生DNP-Ser和DNP-Lys。
此七肽与胰蛋白酶反应，同样能生成2个肽。
它们的氨基酸组成分别为Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。
写出该七肽的氨基酸顺序。
解答：①由于在胰凝乳蛋白酶作用前，此肽不与FDNB反应，即此肽不含有游离的N末端，那么可断定这是一个环肽。
②根据第二句话，由于胰凝乳蛋白酶作用位点是含芳香环的氨基酸，那么这次反应位点是Phe的C端。
③据第三句话，可以分析，A肽顺序为Ser-X-Y（X、Y为Ala或Tyr），B肽顺序为Lys-Z-W-Phe （Z、W为Arg或Pro）④据第四句话，由于胰蛋白酶水解碱性氨基酸（Arg或Lys），由于获得的二肽是Arg和Pro，那么断裂位点在Arg的C末端。
根据以上四点分析，可知这是一个环肽，顺序为—Phe—Ser—Ala—Tyr—Lys—Pro—Arg—2.用下列实验数据推导某寡肽的一级结构并简述判断的理由。
（10分）1) 完全酸水解后产生的氨基酸组成为：Ala、Arg、2Ser、Lys、Phe、Met、Pro；2) 用DNFB处理并水解得到DNP-Ala；3) 羧肽酶A和B对此肽不起作用;4) 用CNBr处理获得2个片段, 1个片段含有Pro、Trp、Ser；5) 用糜蛋白酶作用产生3个片段，1个含有Pro、Ser；另一个含有Met、Trp；最后1个含有Phe、Lys、Ser 、Ala 、Arg；6) 用胰蛋白酶处理产生3个片段，1个含有Ala、Arg；另一个含有Lys 、Ser；最后1个含有Phe、Trp 、Met 、Ser 、Pro。
蛋白质多肽链氨基酸序列的测定
肽段经过分离纯化后， 即可进行氨基酸测序。但是 获得数据之后，还不能得出 整条多肽链的氨基酸排列顺 序，因为尚不清楚这些片段 在多肽链中的先后次序。一 般需要用到多种水解法，并 分析出各肽段的氨基酸顺序， 然后经过组合排列对比，最 终得出完整肽链中的氨基酸 序列。
六、确定肽段在多肽链中 的次序
一、氨基酸组成
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨 基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分 开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋 白质中的百分组成或个数。
二、末端测定的具体方法
二硝基氟苯法（DNP法） 肼解法 化学法 二甲基氨基萘磺酰氯法 （Dansyl-氯法） 还原成氨基醇法
酶解法
亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法
羧肽酶 CpA CpB CpC 来源 胰脏 胰脏 植物或微 生物 专一性 能释放除Pro、Arg、Lys外的所有 的C-端氨基酸 主要水解C-端为Arg、Lys的肽键 相当广泛，几乎能释放C-端的所有 氨基酸
还原成氨基醇法
• 多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4） 还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨 基酸种类。 • Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采 用此法。
耦联： 使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性 条件下对蛋白质或多肽甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。 水解： PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基 肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基 的噻唑啉酮苯胺衍生物。
萃取： 将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应 液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基 的肽仍留在溶液中。 转化： 萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸 作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内 酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。
氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 更精确、 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 方法出现，很多因素如温度、时间、 试剂、添加剂、 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 程度均有影响。 • 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
样品纯度必须>97%以上； 纯度必须>97%以上 1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 测定蛋白质的相对分子质量 相对分子质量； 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法， SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 测定蛋白质多肽链种类和数目 多肽链种类和数目； 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS种类： SDS-PAGE 数目： 末端氨基酸残基摩尔数/ 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 测定蛋白质的氨基酸组成 氨基酸组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数； 种氨基酸的个数；
• 1、酸性水解
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中 是最 通用的水解剂。 通用的水解剂。 • 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为 ～ 条件： 、真空、 ℃ 水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 • 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 和苏氨酸被部分水解，损失分别为 和 。
多肽序列分析题答案
2.根据以下实验结果推断一多肽链的氨基酸序列：
（1）酸水解测出的氨基酸组成为：2Ala,Arg,2Lys,Met,Phe,2Ser。
（2）用羧肽酶水解最先得到氨基酸为Ala；
（3）胰蛋白酶水解得四个肽段，其氨基酸组成如下：①Ala,Arg；②Lys,Phe,Ser；③Lys；④Ala,Met,Ser。
（4）溴化氰水解得到两个肽段，其氨基酸组成如下：①Ala,Arg, 2Lys,2 Met,Phe,Ser；②Ala,Ser。
（5）嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段，其氨基酸组成如下：①Ala,Arg, Ser；②Ala, 2Lys,Met,Phe,Ser。
由(1)得知该多肽为九肽。
由(2)得知，羧基端为Ala。
由（3）得出有如下肽段：
①Ala-Arg；②（Phe-Ser）-Lys；③Lys；④（Met-Ser）-Ala
由（4）中的②和（2）知：Ser紧邻Ala。
结合(3)中的④可知C端：……Met-Ser-Ala————⑤
由（5）中的②和噬热菌蛋白酶的专一性可知：
……Phe（Ala，Lys，Met, Ser）————⑥
由⑤、⑥和（5）中②可知……Phe-Lys-Lys- Met-Ser-Ala————⑦
结合⑦，由（3）中①和②可知：⑦片段的N端：Ala-Arg-Ser 因此，本题答案：Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys- Met-Ser-Ala
噬热菌蛋白酶的专一性：水解N端连接Phe、Leu、Ile、Trp、Tyr、Val、Met的肽键，形成带有游离氨基的肽段。
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
• 2、碱性水解
• 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。 例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮 气后填充管，110 ℃水解22h。 • 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨 酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外 消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限 于测定色氨酸的含量。
• 1、茚三酮反应
• α-氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨 酸和羟脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生蓝紫
色物质。
• 此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅， 在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含 量。
• 2、柱后荧光胺法
荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应，其 荧光产物的激发波长390 nm，发射波长475 nm。 荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应 的灵敏度大约提高了3个数量级。
总之，蛋白质水解阶段所采用的方法 不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。 对于不同的蛋白质、不同的研究目的、以及 样品量的多少，应采取不同的水解方法。
二、特殊氨基酸的保护
不同水解条件下，各种氨基酸的回收 有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半 胱氨酸可能遭水解破坏，导致无法正确测 定其含量。 因此水解过程中，需要考虑对特殊氨 基酸的保护。
• 相关措施：
• 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时， 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 • 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、ValVal、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 长水解时间如水解92h甚至120h来解决。但是长时 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。 • 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。
N端测序：蛋白质氨基酸序列的开端分析
N端测序：蛋白质氨基酸序列的开端分析
N端测序，特指蛋白质的N-末端测序，是用于确定蛋白质氨基酸序列开始部分的方法。
下面是关于N端测序的详细解释：
图1。
一、原理：
N端测序的经典方法是利用Edman降解。
在此过程中，蛋白质的最N端的氨基酸逐一被选择性地移除并被识别。
二、过程：
1、首先，蛋白质的N-末端与特定的化学试剂反应，形成一个可分离的化合物。
2、该化合物可以从蛋白质的其余部分分离出来，并被识别，从而确定最N端的氨基酸。
3、重复此过程可连续确定蛋白质的多个N端氨基酸。
三、优势：
1、具有较高的准确性和灵敏性。
2、能够准确地识别蛋白质的前几个氨基酸。
四、限制：
1、由于每次只能测序一个氨基酸，所以速度相对较慢。
2、对于长链蛋白质，该方法可能不太实用。
3、随着序列长度的增加，测序效率和灵敏度可能会下降。
五、应用：
N端测序在生物医学研究、疾病诊断和药物开发中都有广泛的应用，如：
1、确定蛋白质的起始位置。
2、辨别蛋白质是否经历了修饰或加工。
3、蛋白质鉴定和纯化。
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3) 数据及图谱处理： PPSQ-33A 产生的原始数据及图谱由 PPSQ-30 DataProcessing 软件识别标峰并导出 对于图谱。
多肽蛋白质 N-端序列分析
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3. 实验仪器
1) PPSQ-33A 全自动蛋白质多肽测序仪，SHIMADZU
报告编号：«报告编号»
4. 材料和试剂
1) 甲醇(10014118，国药) 2) Prosorb(401950，ABI) 3) PTFE 滤膜(292-21429-91，SHIMADZU) 4) BioBrene Plus (400385，ABI) 5) PVDF 膜(RPN303F，GE) 6) PTH-Amino Acids Mixed (163-12271，Wako) 7) 37% Acetonitrile Solution(S4B)(014-13831，Wako) 8) Ethylagetate(S2)(054-0498，Wako) 9) PTH Amino Acids Mobile Phase(161-1427，Wako) 10) 5% Phenylisothiocyanaten-Heptane Solution(168-1416，Wako) 11) 25% Triflμoroacetic Acid Solution (RAcid(R3)(204-10771，Wako) 13) 12% Trimethylamine Solution(R2)(207-10761，Wako)
6. 实验结果和分析
a) 标准品校准测试 为对 19 种 PTH-氨基酸进行校准，故先测试 19 种 PTH 氨基酸的混合标准品，校 准测试混合标准品图谱见(图 2)。
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多肽蛋白质 N-端序列分析
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图 2 标准品校准测试图谱 b) 供试品测试分析
PTH 氨基酸混合标准品校准测试完成后，测试供试品的 N-端序列，供试品测试 图谱见(图 3)，进行 15 个循环测试，所得测试原始文件见附件 2。
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供试品：«供试品名称»
上海中科新生命生物科技有限公司 2015 年 4 月 19 日
报告编号：«报告编号»
«供试品名称»的多肽蛋白质 N-端序列分析
供试品名称：«供试品名称» 供试品批号：«供试品批号» 委托单位：«委托单位» 检测人员： 核验人员： 技术服务部负责人：
多肽蛋白质 N-端序列分析
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1. 供试品信息(客户提供)
供试品名称：«供试品名称» 供试品状态：«供试品状态» 供试品批号：«供试品批号» 理论 N 端氨基酸序列：«理论序列»
报告编号：«报告编号»
2. 实验目的
蛋白质的生物合成都起始于 N 端，其 N 端序列的组成对生物学功能有着巨大的影响， 例如蛋白质的半衰期，蛋白质在亚细胞器中的定位等等，而且 N 端可发生多种翻译 后修饰，这些也与蛋白质的功能和稳定性息息相关。因此，对于蛋白质 N 端序列的 分析，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。并且随着现 代医药工业的发展，出现了大量的蛋白质和多肽类药物分子，对这些蛋白质多肽类 药物分子 N 端序列的分析确认也是医药工业质量控制的重要环节。目前对蛋白质 N 端序列分析的方法分为两大类，其一为非质谱技术，例如经典的 Edman 降解法、RTPCR 反转录法；其二为质谱技术，这两种方法都有其使用的长处和制约之处，市面 上采用基于经典的 Edman 降解法的 N 端序列分析方法较为普遍，利用蛋白质序列测 序系统进行蛋白质 N 端序列分析。本实验的目的是通过岛津全自动蛋白质多肽测序 仪(PPSQ-33A)对供试品的 N 端序列进行分析，提供确定蛋白质 N 端序列的实验数据。
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图 3 供试品 N-端序列测试图谱
7. 附件(电子版)
附件 1 空白循环测试结果 附件 2 PTH 氨基酸混合标准品测试结果 附件 3 供试品测试结果 以上均由 PPSQ-30 DataProcessing 软件导出后，得到原始图谱文件(.pdf 文件)共 3 个文 件。
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目录
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1. 供试品信息(客户提供) ................................................................................ 3 2. 实验目的 ................................................................................................... 3 3. 实验仪器 ................................................................................................... 4 4. 材料和试剂 ................................................................................................ 4 5. 实验原理和方法 ......................................................................................... 5 A) 实验原理.................................................................................................... 5 B) 实验方法.................................................................................................... 6 6. 实验结果和分析 ......................................................................................... 6 A) 标准品校准测试.......................................................................................... 6 B) 供试品测试分析.......................................................................................... 7 7. 附件(电子版).............................................................................................10 8. 结论 .........................................................................................................11
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5. 实验原理和方法
a) 实验原理 Edman 降解法是异硫氰酸苯酯(PITC)在弱碱(TMA)条件下与蛋白质 N 端 α 氨基偶 联生成苯氨基硫甲酰肽(PTC-蛋白质)，然后在无水强酸(TFA)条件下，N-端的第一 个残基从完整的多肽蛋白链上以 2-苯氨基噻唑啉酮(ATZ-AA)的形式裂解下来，之 后在稀酸(25% TFA)条件下，ATZ-AA 转化为更加稳定的苯基乙内酰硫 N 脲衍生物， 即 PTH-氨基酸如(图 1)，生成的 PTH-AA 输送至高效液相色谱中进行在线分析， 剩下的多肽蛋白供试品可反复进行上述处理，依次生成各种 PTH-AA，经液相系 统色谱柱分离可以确定被测多肽蛋白质供试品 N 端的氨基酸排列顺序。
图 1 Edman 降解法示意图
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报告编号：«报告编号» b) 实验方法
1) 液体样品处理： 加 40μl 甲醇到 Prosorb 装置的 PVDF 膜上，待滤过后；加入 40μl 0.1%TFA 溶液， 待滤过后；再加入供试品，供试品的量需大于 50pmol，滤过后；再分别加入 两次 600μl 0.1%TFA 进行滤过。将 Prosorb 放入已预热至 50℃的加热器中烘干， 用 PorSorb Punch(图 1)切下 PVDF 膜，上样。
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8. 结论
综上所述，供试品«供试品名称»(批号：«供试品批号»)的 N 端序列为：xxxx
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