第五章分子生物学研究方法朱玉贤版.ppt
分子生物学研究方法朱玉贤
• 50年代末至60年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表 达。
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• 1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术, 于1972年获得第一个重组DNA分子,1973年Cohen第一例成 功的克隆实验:完成第一例细菌基因克隆。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤 膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和 二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)
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核酸分子杂交实验包括如下两个步骤: 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,
这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting);
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4. DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧 链终止法测定单链DNA的序列,其基本原理如下: ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确 的DNA互补链; DNA聚合酶常用Klenow大片段, 无5'→3'外切酶活性。
2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
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(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a.在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b.用上述大肠杆菌培养T2噬菌体,分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c.分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d.培养一段时间后,将混合液离心,检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体,沉淀物主要是大肠杆菌。
(4)基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划,其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息,并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学,其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上,应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能,以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说,重组DNA技术并不完全等于基因工程,因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
2024版《现代分子生物学》朱玉贤第五版北大课件
新生肽链经过加工修饰,如剪切、 折叠、修饰等,成为具有生物活性 的蛋白质。
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蛋白质翻译后加工修饰类型举例
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N-端fMet或Met的切除
新生肽链N-端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸通常被切 除。
二硫键的形成
半胱氨酸残基之间可以形成二硫键,对蛋白质的稳 定性和活性有重要作用。
化学修饰
生物工程
表观遗传学机制可以影响细胞的分化和发育,因此通过表观遗传学手段来改造细胞或生物体可能成为一种新 的生物工程技术。例如,利用表观遗传学手段来实现细胞重编程和再生医学应用。
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现代分子生物学技术应用与 发展趋势
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DNA测序技术原理及应用领域拓展
DNA测序技术原理
通过特定的生物化学方法,将 DNA片段化并逐一测定其碱基序 列,从而获得完整的基因序列信
组修复等。
DNA损伤修复对于维持细胞基 因组稳定性和防止突变具有重要
意义。
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基因突变与遗传多样性
基因突变是指DNA序列中碱基的替换、 插入或缺失。
基因突变是生物进化的原材料,对于 生物适应环境和进化具有重要意义。
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基因突变可以产生新的等位基因,增 加遗传多样性。
序列比对与注释
01
利用生物信息学方法对基因序列进行比对和注释,揭示基因功
能和进化关系。
基因表达谱分析
02
通过高通量测序技术,研究基因在不同条件下的表达谱变化,
解析基因调控网络。
蛋白质结构与功能预测
03
利用生物信息学方法预测蛋白质的三维结构和功能,为药物设
计和蛋白质工程提供理论支持。
北大分子生物学课件朱玉贤优秀ppt文档-2024鲜版
分子生物学与其他生物学科的交叉融合
分子生物学与遗传学、细胞生物学、发育生物学等生物学科相互渗透、交叉融合,共同推动 着生命科学的发展。
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分子生物学在医学、农业等领域的应用
分子生物学的研究成果在医学、农业等领域得到广泛应用,为疾病的诊断、治疗和农作物的 改良等提供了有力支持。
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DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤,如碱 基错配或脱落,可通过特定的酶
直接进行修复。
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切除修复
对于较复杂的DNA损伤,如嘧啶 二聚体等,需要先将损伤部位切除, 然后通过DNA聚合酶和连接酶的 作用进行修复。
重组修复
在某些情况下,DNA损伤过于严重, 无法直接修复,此时可通过DNA重 组的方式,利用未损伤的同源序列 进行修复。
基因克隆技术应用
用于基因功能研究、基因工程疫苗研制、基因治疗等。
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DNA测序技术及应用
DNA测序技术
通过特定的方法和技术,对DNA序列进行测定和分析。
DNA测序技术应用
用于基因组学研究、疾病相关基因鉴定、个性化医疗等。
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分子生物学在医学、农业等领域的应用
医学领域应用
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RNA的二级结构
01 02
A型RNA双螺旋
RNA的二级结构大多数都是单链,但是可以形成局部双链结构,这些双 链结构是由于碱基配对形成的,常见的A型RNA双螺旋结构中的碱基对 是A-U和G-C。
05分子生物学研究法99页PPT
PCR三步曲
变性 90~97℃ 退火 45~55℃ 延伸 72℃
变变 90变95变
70变75变
变变
PCR
变1) 将mRNA反转录为双链DNA. (2) 特点: A.稳定者组织mRNA中所含的全部或绝大部 分遗传信息.
名称
检测对象
探针
检测原理 处理过程
用途
Southern blot
DNA
标记单链核 酸
核酸复性中 碱基配对专
一性
琼脂糖电泳 后转膜
基因检测 (拷贝数)
Northern blot
RNA
标记单链核 酸
核酸复性中 碱基配对专
一性
变性琼脂糖 电泳后转膜
基因表达的 检测(表达
量)
Hale Waihona Puke Western blot蛋白
抗体
加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA,测定浓度
琼脂糖凝胶电泳技术要点
1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样 (p33) (1)低: 不利于小片段的分辨(扩散) (2)高: 不利于大片段的分辨(迁移不动) (3) 一般选1.0%
2. 凝胶要用缓冲液配( TBE 或 TAE ) 3. EB强致癌,带手套操作; 4. agarose (琼脂糖)---电泳
3.SDS-PAGE测定的是单体蛋白分子量;(多亚基不行) 4、SDS-PAGE不适于:
(1)电荷异常蛋白:组蛋白(+电多) (2)构象异常的 蛋白 (3)带有较大辅基的蛋白--糖蛋白,脂蛋白。
PCR技术
1、原理 2、应用 3、技术要点
PCR技术原理
5’
3’
3’
5’
循环过程(32 次左右) 1.解链:94 ℃, 30 s 2.引物结合: ? ℃ ,30 s 3. 延伸:72 ℃,?Min
现代分子生物学(第四版)朱玉贤课件 PPT 第1章 绪论
主要教材与参考书
1.《现代分子生物学》 第3版(2007)朱玉贤、李毅、郑晓峰
2. 现代生物学精要(Instant Notes)系列 《分子生物学》第二版(2002)刘进元 《Molecular Biology》2e P.C.turner,et al 3. Principles of Biochemistry
1994 Gilman Rodbell 美国
1995
Lewis Nusslein-Volhard Wieschaus
美国 德国 美国
建立DNA测序方法
诺贝尔生理医学奖
建立和发展了单克隆抗体技术
诺贝尔生理医学奖
发现可移动癌基因
诺贝尔化学奖 诺贝尔生理医学奖
G蛋白在细胞内信息传导中的作用 诺贝尔生理医学奖
发现了控制果蝇体节发育的基因
诺贝尔生理医学奖
年份
科学家
Doherty 1996 Zinkernagel
国籍
澳 瑞士
1997 Prusiner
美
Furchgott
美
1998
Ignarro Murad
1999 Blobel
美
Carlsson
德
2000 Greengard
预计到2020年,生物医药占全球药品的比重 将超过1/3,生物质能源占世界能源消费的比 重将达5%左右,生物基材料将替代10%-20%的 化学材料。
生物制造、生物能源、生物环保等一 批新兴产业正在快速形成。
据Ernst&Young研究报告,2010年生 物环境、生物工业处理、生物海洋技术世界市 场规模将达到 134亿美元、327亿美元、288 亿美元。
第五章分子生物学研究方法20220313230.pptx
❖跨越天然物种屏障、把来自任何生 物的基因置于毫无亲缘关系的新的 寄主生物细胞之中的能力,是基因 工程技术区别于其他技术的根本特 征。本章将在回顾重组DNA技术史 上主要事件的基础上,讨论DNA操 作技术、基因克隆的常用载体系统 以及基因的分离与鉴定等3个环节。
5·1 重组DNA技术史上的重大事件
❖ 他们还发现,EcoRl酶切产生的任何不 同来源的DNA片段能通过粘性末端之间 碱基互补作用而彼此“粘合”起来。
❖ 此后,大量类似于EroRl但具有独特识 别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目 前为止,科学家已经几乎能随心所欲地 把任何DNA分子切割成一系列不连续的 片段,再利用凝胶电冰技术将这些片段 按照分子量大小逐一分开,以供下一步 研究。
❖ DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列 分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的 产生和发展。
❖ 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史 上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特 定碱基序列位点切开DNA。1972,Boyer实 验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别 GAAUC序列,将DNA在这个位点切开产生 具有粘性末端的小片段。
第五章 分子生物学研究方法
❖ 2·琼脂糖凝胶电泳 ❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂
糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成 良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔 点琼脂糖,在较低的温度下便会熔化, 常用于DNA片段的制备电泳。
最新2019-分子生物学(中文)5 分子生物学基本研究法-PPT课件
扉页: 当你进入实验室时,要像脱去外衣那样放
下你的想象力,因为实验操作中不能有一丁 点儿的想象,否则,你对事物的观察就会受 影响;当你翻开书本的时候,你又必须尽可 能展开想象的“翅膀”,否则,你就不可能 走在别人的前面。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞 转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定 点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技 术。
• 松弛型质粒DNA却继续复制数小时,使每个寄主 细 胞 中 ColE1 质 粒 的 拷 贝 数 达 到 1000~3000 个 , 占细胞总DNA的50%左右。
3、pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的:
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因(AmpR);
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因(tetr);
RE 切割随机DNA分子(假定4种碱基在 DNA中均匀分布)的概率由该酶所识别的碱 基数目按照4n 来计算,如一个6碱基切割酶平 均每4096 bp核DNA有一个酶切位点(46), 而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就 有一个酶切位点(44)。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶
类
功
能
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同 样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之 间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高, 孔隙越小,其分辨能力就越强。
(iii)编码有一个氨苄青霉素抗性基因, 作为转化子克隆的选择标记;
分子生物学-研究方法(上)PPT课件精选全文完整版
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32
1个PCR循环产生2条双链分子
一般每完成一个循环需2-4分钟,2-3小时就能 将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
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PCR的基本原理
模板DNA
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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基因工程技术区别于其它技术的根本特征:具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶, 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
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6
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段, 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开,以供下一步研7究。
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42
(3)PCR的应用
• 反向PCR:扩增已知序列旁侧的未知DNA序列
• 锚定PCR: 用于测定基因结构
• 不对称PCR: 用于扩增某一单链模板
• RT-PCR(逆转录-PCR): 逆转录联合PCR以扩增cDNA
• 复合PCR: 用多对引物同时扩增几条DNA片段
• 易错PCR:引入错配碱基,导致随机突变
分子生物学课件重点整理朱玉贤
第二章染色体与DNA染色体(chromosome)是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式,是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。
真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。
染色质是一种纤维状结构,叫做染色质丝,它是由最基本的单位—核小体(nucleosome)成串排列而成的。
原核生物(prokaryote) :DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。
染色体由DNA和蛋白质组成。
蛋白质由非组蛋白和组蛋白(H1,H2A,H2B,H3,H4)DNA和组蛋白构成核小体。
组蛋白的一般特性:P24①进化上的保守性②无组织特异性③肽链氨基酸分布的不对称性:碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
④组蛋白的可修饰性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。
⑤H5组蛋白的特殊性:富含赖氨酸(24%)(鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5)组蛋白的可修饰性在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。
H3、H4修饰作用较普遍,H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。
所有这些修饰作用都有一个共同的特点,即降低组蛋白所携带的正电荷。
这些组蛋白修饰的意义:一是改变染色体的结构,直接影响转录活性;二是核小体表面发生改变,使其他调控蛋白易于和染色质相互接触,从而间接影响转录活性。
2、DNA1) DNA的变性和复性■变性(Denaturation) DNA双链的氢键断裂,最后完全变成单链的过程称为变性。
■增色效应(Hyperchromatic effect)在变性过程中,260nm紫外线吸收值先缓慢上升,当达到某一温度时骤然上升,称为增色效应。
■融解温度(Melting temperature ,Tm ) 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。
生理条件下为85-95℃影响因素:G+C含量,pH值,离子强度,尿素,甲酰胺等■复性(Renaturation)热变性的DNA缓慢冷却,单链恢复成双链。
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6. 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
a.凝胶滞缓 实验(Gel retardation assay), 又称DNA迁 移率变化试 验(DNA mobility shift assay-EMSA)。
b. DNase I 印迹试验(DNase I foot printing) • 主要步骤:
(3). PCR(聚合酶链式反应)基本原理
(4) . PCR的主要步骤
• ①.高温变性
在高温(93-95℃)下,待扩增的双链DNA模 板受热变性成为两条单链DNA模板。
• ②.低温退火
在低温(37~60℃)情况下,两条人工合成的 寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部 分双链。
• ③.适温延伸
• DNA的脉冲电场电泳技术 :PFGE-
Pulse-field gel electrophoresis
2. 核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶 电泳 分离的DNA或RNA分子,都是在杂交 之前,通过毛细管作用或电导作用按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到 滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素 滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM) 和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)
b. DNA序列分析自 动化(分析反应\读 片过程 )
用四甲基若丹明 (Tetramethylrhoda mine)作为荧光剂 标记DNA引物,带 有这种引物的DNA 片段能在激光诱导 下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止 法或化学终止法进 行测序反应,跑 DNA凝胶后,用计 算机检测。
DNA测序的全过程(实际)
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:
1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上, 这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting);
7. PCR技术(基因的体外扩增法)
• (1).概念
PCRA序列的方法。 也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。
特别注意:
经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n 个新生的DNA分子。
( 2). 一个PCR体系的基本组成
• 超纯水 • 缓冲液 • Mg2+ • dNTPs • DNA模板 • 引物 • TaqDNA聚合酶
• 在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是 离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放 到电场中,它就会由负极→正极移动。
• 在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭 (EB)--ethidium bromide染色,此时,核 酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到 约50ng DNA所形成的条带。
在TaqDNA聚合酶的最适温度(72℃)下,以 引物3’ -OH端为合成的起点,以脱氧核苷三磷酸 (dNTPs)为原料,按5’→3’方向延伸,合成单链 DNA模板的互补链。
(5). PCR的主要步骤小结
2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3. 细菌的转化
所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获 了来自另一种细菌菌株的DNA,而导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的 菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA的寄主菌株 则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验 菌株。在加入转化DNA之前,必须预先用CaCl2 处理大肠杆菌细胞,使之呈感受态(Competent Cells)。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作 用,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
第五章. 分子生物学研究方法
第一节 基因操作的主要技术
原理
1. 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
• 将某种分子放到特定的电场中,它就会以 一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场 作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场 强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正 比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、 极性、介质的粘度系数等)。
②该酶能够用2',3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端,从而终止其 延伸反应。在DNA测序反应中,加入模板DNA, 引物(特异性引物,如T7,T3,M13等),DNA 聚合酶,dATP,dTTP,dGTP,dCTP和一种 ddNTP。
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图
① 用32P标记DNA双链末端,并用RE切去一端; ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物,温育; ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶,使 DNA链发生断裂。 这一反应中,DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关 键,要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断 裂! ④沉淀DNA(包括与DNA相结合的蛋白质); ⑤进行DNA凝胶分析。 • 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合, 那么,它就会保证该区段DNA免受消化或降解作 用。在电泳凝胶的放射自显影图片上,相应于蛋 白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出 现了一个空白的区域,形象地称为足迹。
4. DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱 氧链终止法测定单链DNA的序列,其基本原理如 下: ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确 的DNA互补链; DNA聚合酶常用Klenow大片段, 无5'→3'外切酶活性。
5. 基因的定点诱变(site-directed mutagenesis)
使已克隆基因或DNA片段中的任何一个 特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过 程叫作基因的定点诱变,是基因工程和蛋 白质工程的重要手段。
如: 盒式诱变(cassette mutagenesis),包括盒 式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。