第五章分子生物学研究方法朱玉贤版.ppt

(3). PCR(聚合酶链式反应)基本原理
(4) . PCR的主要步骤
• ①.高温变性
在高温（93-95℃）下，待扩增的双链DNA模 板受热变性成为两条单链DNA模板。
• ②.低温退火
在低温（37～60℃）情况下，两条人工合成的 寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部 分双链。
• ③.适温延伸
4． DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱 氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确 的DNA互补链； DNA聚合酶常用Klenow大片段， 无5'→3'外切酶活性。
2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3． 细菌的转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获 了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的 菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株 则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验 菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2 处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作 用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关 键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断 裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。 • 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合， 那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作 用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋 白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出 现了一个空白的区域,形象地称为足迹。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上， 这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；
6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
a.凝胶滞缓 实验(Gel retardation assay)， 又称DNA迁 移率变化试 验(DNA mobility shift assay-EMSA)。
b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） • 主要步骤：
• DNA的脉冲电场电泳技术 :PFGE-
Pulse-field gel electrophoresis
2． 核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶 电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交 之前，通过毛细管作用或电导作用按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到 滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素 滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）
7. PCR技术（基因的体外扩增法）
• (1).概念
PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种 在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。
特别注意：
经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n 个新生的DNA分子。
( 2). 一个PCR体系的基本组成
• 超纯水 • 缓冲液 • Mg2+ • dNTPs • DNA模板 • 引物 • TaqDNA聚合酶
b． DNA序列分析自 动化(分析反应\读 片过程 )
用四甲基若丹明 (Tetramethylrhoda mine)作为荧光剂 标记DNA引物，带 有这种引物的DNA 片段能在激光诱导 下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止 法或化学终止法进 行测序反应，跑 DNA凝胶后,用计 算机检测。
DNA测序的全过程(实际)
5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一个 特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过 程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋 白质工程的重要手段。
如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒 式取wenku.baidu.com诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
• 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是 离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放 到电场中，它就会由负极→正极移动。
• 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭 （EB）--ethidium bromide染色，此时，核 酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到 约50ng DNA所形成的条带。
在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以 引物3’ -OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸 （dNTPs）为原料，按5’→3’方向延伸,合成单链 DNA模板的互补链。
(5). PCR的主要步骤小结
第五章. 分子生物学研究方法
第一节 基因操作的主要技术
原理
1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
• 将某种分子放到特定的电场中，它就会以 一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场 作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场 强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正 比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、 极性、介质的粘度系数等）。
②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其 延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA， 引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA 聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种 ddNTP。
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图