鸡胚成纤维细胞的制备

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鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。

（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。

（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。

DMSO一定要配成10%。

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。

用碘酒、酒精消毒蛋壳。

用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

消化10－15分钟。

一般约12分钟。

视鸡胚日龄大小而定。

越小消化时间越短。

见组织松软即可。

一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。

（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。

然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。

10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

答案--生物制品复习题

一、填空1、目前基因工程抗体有以下几种类型，包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、 Ig相关分子、噬菌体抗体。

2、按微生物学控制程度由松到严，将实验动物分为普通级动物、清洁级动物，无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物。

7、按遗传质量控制可将实验动物分为四类，即近交系动物、杂交群动物、突变系动物、封闭群动物等。

3、一般生物制品制备流程是：培养增殖、分离纯化、浓缩、制剂、检验。

4、诊断用生物制品的最基本要求是特异性强和敏感度高。

包括诊断用抗原、诊断用抗体和标记抗体三类。

5、细胞因子是一组由机体免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的小分子或中等分子量的可溶性蛋白质与糖蛋白。

根据的细胞因子的生理功能将其为以下种类：、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、促红细胞生长素。

6、基因工程疫苗包括以下几种，即基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白质工程疫苗、转基因植物疫苗。

8、对生物组织与细胞破碎的方法有高压匀浆法、高速珠磨法、超声振荡破碎法、压力法、反复冻融法、化学渗透法、酶溶破碎法等。

20 等。

17、○18、○19 、○9、动物生物制品的质量检验主要包括○16 、○10、抗体具有特异性结合相关抗原、激活补体、结合细胞、介导细胞毒、促进吞噬和通过胎盘等功能。

发挥其抗肿瘤、抗感染、免疫调节与监视、解毒等作用。

11、实验动物通过注射方法给药的方式包有：皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射。

12、生物制品成品的质量检验主要内容包括物理性状检验、无菌检或纯粹检、安全检验、效力检验、其他检验等。

13、对实验动物小白鼠采血的方法有尾静脉、眼眶动脉和静脉（摘眼球法）、眼眶静脉丛、心脏、大血管、断头等。

二、选择题1、下列物质中抗原性最好的是：A、蔗糖B、多肽C、丁酸D、赖氨酸12、下列物质中抗原性最好的是：A、葡萄糖B、蛋氨酸C、乙酸D、多肽2、临产前动物进行计划性疫苗接种，是为了使新生动物获得＿＿。

鸡胚成纤维细胞制备实验

42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。

泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。

[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。

鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。

鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。

原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。

由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。

[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。

2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。

(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。

2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。

先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。

用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。

实验报告——精选推荐

实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。

⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。

通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。

原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。

三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。

4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。

7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。

胚的培养实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。

2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。

3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。

二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。

通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。

- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。

2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。

- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。

3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。

- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。

4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。

- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。

5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。

- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。

五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。

2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。

2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。

3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。

4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。

5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。

6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。

7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。

8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。

9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。

10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。

11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。

12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。

13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。

14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。

15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。

原代培养(13)

二、讨论

自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精擦试，试剂等瓶口也要擦试。点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，
TCID50
（50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的
传统表示法，即能在细胞培养孔或试管内引起50%组织细胞
病变所需的病毒最高稀释度。
实验六干扰素（IFN）效价滴定
干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能
保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒
数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。
实验结果：
一、结果观察：镜下及染色观察，一般病毒对照孔出现3＋或 4＋，干扰素保护孔CPE不再进展时，可终止反应，并染色。
二、效价计算：
实验七中和试验 —稀释血清固定病毒法
实验结果：用倒置显微镜及活细胞染色观察。首先观察对照：
V对照（3+～4+）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为
实验小结
实验一配液
实验二
原代鸡胚成纤维细胞的制备、培养及观察
一、实验结果观察
• 肉眼观察：培养液颜色、浑浊度等 • 镜下观察：细胞的形态、折光性、轮廓等 • 成纤维细胞形态学特征：细胞呈梭形、长条形或不规则形。多数情况下细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式。
指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体的效价（滴度）。

鸡胚成纤维细胞制备

取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。

将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。

最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。

抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。

经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。

体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。

抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。

这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。

效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。

然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。

鸡胚成纤维细胞制备优秀课件

工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理（1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞（1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后，可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。

鸡胚成纤维细胞制备

实验步骤用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个/ml。
37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。 25%胰酶消化液，DMEM营养液，75%酒精棉。 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空
5、细胞培养对玻（璃器2皿）洗分涤要散求细严格胞，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。（2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
37℃培养24-48h后液，。于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。加入PBS（淹住组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。 2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。 1、整个过程严格无菌操作分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免影响细胞的贴壁和生长。
鸡胚成纤维细胞元代培养
CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。

鸡胚成纤维细胞制备

鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备材料准备：干烤好的漏斗，高压好的12层纱布，50ml的烧杯，锥形瓶，剪刀，镊子，平皿，Hank’s液，含10%血清的199培养基，胰酶，19日龄SPF鸡胚（CEK细胞），9日龄SPF 鸡胚（CEF细胞）。

取胚：用新洁尔灭对鸡蛋外壳进行消毒，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75%酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。

取组织：取小烧杯，倒入适量微温Hank’s液，将鸡胚仰放，制备CEK细胞除去胃、肠、肝脏、肺脏、心脏等器官，用小镊子将嵌入在脊椎两侧的肾脏取出，浸泡在Hank’s液中；制备CEF细胞去掉头、翅膀、腿和内脏，将剩余的胴体放入50ml的烧杯。

漂洗，剪碎：用Hank’s也漂洗3次，将组织脏器剪成1mm3左右的小块，再用Hank’s液漂洗3次。

胰酶消化：将小烧杯中的组织小块移到锥形瓶中，加入适量37℃水浴加热的胰酶溶液，放在水浴锅中消化30-35min。

终止消化：待组织体积增大、边缘出现毛边停止消化，小心倒出胰酶，用Hank’s液洗3遍。

制备细胞：除去Hank’s液，加入适量含10%血清的199培养基，剧烈震荡，将液体倒入含12层纱布的漏斗，重复数次，一般按1个胚加入25mL培养基来计算培养基总量。

活细胞计数：用血球计数板进行台盼兰细胞计数。

用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计数板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打，混匀细胞悬液；用微量移液枪从盖片边缘滴加20μL细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中；勿使液体漫过盖片或出现气泡；镜下观察并计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右侧和下方的不计算在内；细胞数/毫升原液=(4大格细胞数/4)×10000×稀释倍数。

每4个大方格计数，以80-120个为宜。

未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，进行活细胞计数：用台盼兰染色进行活细胞计数后，调整CEK、CEF细胞密度至100×104个/mL左右，25cm2塑料细胞培养瓶中接入8mL细胞分散液，置于37℃细胞培养箱静置培养。

实验二_原代细胞培养

生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青霉素、 200μg/ml链霉素的DMEM
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱl 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗液。如此重复1次。
实验二原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞
的制备与培养方法。
A
B
A 上皮细胞 B 成纤维细胞
二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

两种制备鸡胚成纤维细胞的方法比较

睛、四肢，内脏，并用Ｈｎ ’ 液洗涤血液，ａｋｓ将一定量的鸡胚按
消化１即４次）在瓶壁上有少量的死细胞絮状物；次（，而另两组均无肉眼可见的死细胞团，整瓶贴壁均匀光滑。镜检可见
细胞消化分散得很均匀。
三角瓶的大小放入各瓶中，准备消化。每瓶按８ｍＵ胚加入
３ ℃浓度为００５７．％的胰酶消化液，２在磁力搅拌器上以１０～０
Байду номын сангаас
２玻璃珠分散法两组死细胞团较多，．３粘附于瓶壁，较大
而未粘附的团块在瓶子旋转时滑动将所在之处一圈细胞已
刮掉，整体上显得生长不均匀，细胞生长势头无前者旺。镜检时细胞不像前者那样已分散成单个，而是成堆，不均匀。
养液并摇匀，１０ｍ，按００Ｌ瓶分装到细胞瓶，并放入３ ℃的７温室中进行旋转培养。定时观察并做好记录。１采用结合方法制备鸡胚成纤堆细胞．８试验共分２组，分别为１、０７枚／，１瓶按．６项方法制备
１１鸡．
日龄。
胚
购自济南赛斯的ＳＦ种蛋，并自行孵化至１Ｐ０
１ＨａｋＳ．２ｎ ’液按常规配制，并高压灭菌备用。
１乳汉液．３购自美国Ｄｆｏ司的水解乳蛋白干粉，ｉｃ公ｉ按常规配制成Ｏ％浓度的乳汉液，．５高压灭菌备用。
待消化的鸡胚组织。以后方法同胰酶连续消化法，同的是不
２０ｒ／ｉ５ｍｎ速度搅拌消化１ｉ。稍静置后收集上清液，０ｍｎ并在上清液中加入一定量的血清，终止胰酶的消化作用。将剩下的组织按同样的方法再消化２次，２３次胰酶量分别按第、４Ｕ胚和２Ｕ胚加入，ｍｍ消化３— ４遍即可。将所有收集的上

实验一-鸡胚成纤维细胞的培养

02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖的基本原理，了解细胞周期和细胞分裂的过程。
了解细胞培养过程中的注意事项和安全措施。
熟悉细胞培养的基本流程，包括原代细胞的培养和传代细胞的继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征。通过对比不同培养时间的细胞形态，可以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一步了解细胞的生理状态和变化规律。

不同制备方法对鸡胚成纤维细胞产量的影响

维普资讯
中国兽医科技厂生产；０／ｇ鱼石脂软膏，１０ｋｇ由芜湖市第三制药厂生产。
第３２卷
第７期
２００２年
３１
肿．挤静脉血管，致颈静脉淤血硬化。三是采血针头在血管压导
选出颈静脉重度硬化者２９匹．
为试验组．次采血后除颈静脉注射５／每０Ｌ葡萄糖氯化钠注射ｇ
面的影响目前尚不清楚，对抗血浆生产的影响是较大的。但右旋糖酐４Ｏ是一种扩容剂即体液补充剂，有与血浆相似具的胶体特性，替代血浆。根据颈静脉硬化的致病因素．脉可静注射右旋糖酐后．恢复血容量及一定的胶体渗透压，效地抑可有
１３颈静脉硬化判定标准以颈静脉硬化的长度分为三级．．长
内停留时间过长，正常血流受阻而形成淤血。四是因采血量使大．导致血容量减少，压降低．血血液黏稠度增大，流缓慢而不血规则，而破坏血液 “ 流 ” 使血小板等有形成分析出，起血从轴，引
制了外间压力对血管腔的压迫而恢复血流的畅通。同时它还有
液１００ｍＬ并外敷鱼石脂软膏外．体重加注右旋糖酐４０按０氯化钠注射液３ｍＬｋ／ｇ进行治疗；２组１第１匹，为对照组．作只静脉注射５／０ｇＬ葡萄糖氯化钠注射液１００ｍＬ并外敷鱼石脂０

鸡胚成纤维细胞(CEF)制备

取9~11日龄SPF鸡胚，分别用碘酒和酒精棉由鸡胚中央向四周擦拭消毒，然后放入超净台，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子磕破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，注意不让蛋壳碎屑落入蛋内，换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入胚内夹住鸡胚颈部取出，放入平皿中，将取出的鸡胚去脑、四肢、内脏，放入一小烧杯中，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm3左右的小块，再用PBS清洗3遍，至组织块发白为止。

将剪碎的组织块移入另一小烧杯中，加入适量的（1ml左右）0.5%胰酶和9mlPBS，于37℃水浴中消化10min左右。

倒掉PBS和胰酶混合液然后加入生长液25ml终止消化，用枪头充分吹打成单个细胞。

再用8层灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬浮液稀释10倍，使细胞终浓度达到50万个/ml，每个细胞瓶加入8ml。

放入CO2培养箱中，37℃培养24小时，直至细胞长成单层致密，及可以接毒。