暗黑鳃金龟微卫星引物的筛选

暗黑鳃金龟微卫星引物的筛选摘要暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)是花生的主要害虫，盛期时造成花生产量大幅度降低，严重时甚至使花生绝收。

微卫星DNA（microsatellite），又称SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)是以1～6个核苷酸为重复单元组成的短串联重复序列。

经过数据库检索，我们发现暗黑鳃金龟的SSR引物序列从未被发表过，关于暗黑鳃金龟SSR的研究也未见报道，不能满足其种群遗传研究结构的需要。

本研究基于前期测序获得的暗黑鳃金龟转录组序列，筛选其EST(Expressed Sequence Tag，表达序列标签）-SSR序列。

用微卫星搜寻软件MicroSAtellite查找暗黑鳃金龟转录组中的SSR信息，并用Primer 5软件对SSR位点进行引物设计。

结果表明，暗黑鳃金龟转录组中富含大量的SSR位点。

在58,763条序列中共搜寻到14,433个SSR位点，分布在10,686条序列中，平均每3.58kb就能发现一个SSR位点。

基于上述数据，我们设计了32对SSR引物并将之用于梯度PCR扩增，其中扩增出特异性条带的引物有22对。

这说明基于转录组数据开发暗黑鳃金龟的微卫星引物是可行的，本研究不仅丰富了暗黑鳃金龟在SSR方面的研究，也为近缘种群的遗传学研究提供了工具。

关键词：暗黑鳃金龟；简单重复序列；引物；筛选IAbstractHolotrichia parallela is the main pest of peanut. Peanut yield was greatly reduced in peak period, and even no peanut harvest was achieved in severe period. Microsatellite DNA (SSR), also known as simple sequence repeat (SSR), is a short tandem repeat sequence consisting of 1 to 6 nucleotides as repeat units. After searching the database, we found that the SSR primer sequence of the Holotrichia parallela has never been published, and the SSR research of the Holotrichia parallela has not been reported, which can not meet the needs of population genetic research structure. EST-SSR sequences were screened, based on the transcriptome sequences obtained previously. MicroSAtellite (MISA) microsatellite search software was used to find SSR information in the transcriptome of the dark black chafer Holotrichia parallela. Primer 5 software was used to design primers for SSR loci. The results showed that there were a large number of SSR loci in the transcriptome of H. parallela. A total of 14,433 SSR loci were found in 58,763 sequences, which were distributed in 10,686 sequences, with an average of 3.58 kb. Based on the above data, 32 pairs of SSR primers were designed for gradient PCR amplification, and 22 pairs of primers with single specific bands were screened. This indicates that it is feasible to develop microsatellite primers based on transcriptome data. This study not only enriches the SSR research of Holotrichia parallela, but also provides a tool for population genetics research of this pest and its related species.Key words:Holotrichia parallela; SSR; Primer; Screening目录第1章前言 (1)1.1 研究背景 (1)1.1.1 暗黑鳃金龟简介 (1)1.1.2微卫星简介 (2)1.2 研究热点 (2)1.3 研究的目的与意义 (2)1.4研究的主要内容 (3)1.5 技术路线 (3)第2章材料与方法 (4)2.1 样品的采集和标本的制备 (4)2.2 主要实验试剂 (4)2.3 主要实验仪器 (4)第3章实验方法 (5)3.1 总DNA的提取 (5)3.2 转录组SSR序列筛选 (5)3.3 暗黑鳃金龟SSR引物设计及PCR扩增 (5)第4章结果与分析 (6)4.1 EST-SSR的数量及分布特征 (6)4.2 DNA提取结果 (8)4.3 PCR扩增结果及引物的初步筛选 (9)第5章结论 (14)第6章讨论 (15)参考文献 (16)第1章前言1.1 研究背景1.1.1 暗黑鳃金龟简介暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）属昆虫纲，鞘翅目，金龟科（最好加上拉丁文），是一种世界范围内危害程度较为严重的害虫［1］，一年发生一代。

其幼虫（又称蛴螬）终年在土壤中栖息生活，为害隐蔽，主要危害时间为每年的7月中旬至10月。

幼虫体型肥大，常弯曲呈C字型，有假死性和负趋光性，且对未腐熟的粪肥有趋向性；喜食萌发的种子以及植物的根、块茎等地下部分及嫩苗，致使植物缺乏水分或缺乏营养，对植物造成间接性的危害。

成虫出土活动，飞翔能力不强，有明显的趋光性和假死性。

每年5月中旬成虫开始羽化，六月下旬至7月下旬为发生盛期，8月中下旬发生结束［2］。

成虫有隔日出土和昼伏夜出的习性，一般在傍晚8点左右出来觅食及交尾，至天明之前返回土壤中藏身。

其食量大，有集群取食的习性，可以将某一地段或某一单株树的树叶迅速吃光，对植物造成严重的损害，以三龄幼虫和少数成虫越冬［3］。

（这部分需要注意的是重复问题，还有描述过多，要合理引用）暗黑鳃金龟是花生的主要害虫（危害虫态），盛期时造成花生产量大幅度降低，严重时甚至使花生绝收［4］。

（危害虫态）它也危害大豆等粮食作物以及榆树、杨树、柳树、梨树和苹果树的叶和花等地上部分［5］，食性较杂。

近年来，暗黑鳃金龟对我国农作物的危害日益严重，其危害程度在金龟子类中逐渐上升到首位［6］。

暗黑鳃金龟在我国黑龙江、河北、山东、安徽、青海、四川等20多个省区广泛分布，其环境适应能力较强。

在不同地区种群间存在生态适应性差异，如对温度感受差异，以及出土规律的差异等。

暗黑鳃金龟成虫飞翔能力有限，无迁飞现象，种群扩张主要依靠自然扩散，易形成地理隔离的种群。

同时由于成虫喜食树木叶片，不同景观环境对其分布也有影响。

因此研究不同地理种群，甚至不同景观尺度下暗黑鳃金龟的地理谱系遗传学、群体遗传学以及景观遗传学对于理解暗黑鳃金龟特种分布格局有重要意义，有助于种群分布预测以及提出基于景观的生态防控策略。

1.1.2微卫星简介微卫星DNA（microsatellite）又称SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)或短串联重复序列（short tandem repeats），是指以1～6个核苷酸为重复单元组成的短串联重复序列［7］。

SSR广泛分布于真核生物和部分原核生物的基于组中。

SSR的总长度可达到几十到几百bp（base pair，碱基对），SSR每单元长度在1～10 bp之间,以2～3个碱基重复类型为主。

由于重复次数不同，每个SSR位点之间具有多态性。

SSR数量丰富，覆盖整个基因组，具有高多态性、高可重复性、多等位性、以及共显性等特点［8］。

SSR位点两侧为相对保守的单拷贝序列，在长期的自然选择和人工选择下不易丢失［9］，因此在品种鉴定、遗传多样性分析等方面有很好的应用［10］。

SSR已经被广泛应用于生物遗传研究中。

1.2 研究热点（这个标题不好，好好想想）目前对暗黑鳃金龟的研究主要集中在一些生活习性，如耐寒性的研究以及发生与防治现状的研究等方面。

防治方法与防治技术是目前的研究热点，当前暗黑鳃金龟的防治方法有许多，如物理防治法、化学防治法、生物防治法和农业防治法等［11］，对其种群遗传方面的研究还较少。

杨效文等利用SSR位点对棉蚜的种群分化做了深入分析［12］。

龚鹏［13］等利用微卫星标记，对棉蚜的DNA多态性进行分析，明确了不同蚜型之间的遗传关系。

魏丹丹［14］等搜寻桔小实蝇的微卫星位点，开发出18对可扩增出预期片段大小的引物，为进一步的种群遗传结构、评估遗传多样性等奠定了基础。

1.3 研究的目的与意义（没有很好的说明自己为什么做这个，做这个有哪些意义，只是很简单的说了一下没人做过，我这个可以为以后打下基础，而对于这种害虫的防控有哪些意义，对其他方面有哪些影响没有说）经过数据库检索，我们发现暗黑鳃金龟的SSR引物序列从未被发表过，关于暗黑鳃金龟SSR的研究也未见报道，不能满足其种群遗传研究结构的需要。

为了筛选高质量SSR，我们在转录组数据中筛选EST-SSR序列，并根据序列特征设计SSR引物，检测引物的特异性和扩增产物长度在不同个体中的多态性。

本研究将为暗黑鳃金龟以及其他近缘物种的种群遗传学研究奠定基础。

1.4研究的主要内容：这部分是不是这样格式，参考一下文献和撰写要求（1）暗黑鳃金龟肌肉组织DNA提取；（2）基于转录组序列筛选SSR位点；（3）PCR扩增结果及引物的初步筛选。