DNA测序结果中常见的几个问题
测序常见问题分析与解答
测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1。
5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序技术的使用中常见问题
DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。
然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。
1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。
低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。
常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。
解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。
- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。
- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。
2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。
然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。
解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。
- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。
3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。
然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。
解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。
选择合适的方法来检测特定类型的突变。
- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。
- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。
4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
有机物污染（瀑布效应）
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA测序中的一些常见问题和对策
其抗 <+ 抗体属中和抗 $%&’# 和 $%&’! 的共同抗原决定簇， 体， 中和病毒的能力最强， 能与 $%& 的 <+ 抗原特异结合， 结 果改变了病毒的表面结构， 阻断了病毒对宿主细胞的吸附，
［@］ 使病毒失去了感染能力 。本实验所用的 5678% 中既有能
识别 $%& 的 <;、 也有 <+ 抗原的型共同性特异性单克隆抗体， 能识别 $%& 的 <= 的型特异性单克隆抗体， 体外中和试验也 证明其中和效价为 #( 2 #( ， 具有很强的中和病毒的作用
［$， %］ 序， 都存在下列问题 。
点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化， 注意纯化后要进行 电泳检测。 # 测序信号提前共同终止， 测序反应无法继续进行
［@］ 、 常见原因： 模板 !"# 中有二级结构形成 8"?& 浓度不
当或模板浓度过大， 导致测序反应提前终止。 对策： 一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题， 若为 自制试剂， 可予替换或重新配制， 再重复实验。由于测序反 应要求模板必须为单链， 所以对于二级结构形成导致的测序 反应共同终止， 可以提高模板变性温度使之充分分解为单 链， 或加入甲酰胺使模板变性充分、 彻底。 $ 无正常测序信号 常见原因： 引物设计不当或模板 3A’ 含量过高。 对策： 测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者 是针对不同克隆载体设计的引物， 一般不会存在上述问题。 特异性引物是指与模板特异性且唯一性结合的引物， 设计原 则如下： （$） 引物长度 ! $= .B， 一般 %)%C .B； （ %） 3A’ 含量 ! 一般为 C)D<)D （ ；@） 避免引物自身形成互补； （ E） C)D ， @F 末 端为 3 或 ’ 更为合理。模板 3A’ 含量过高者可采用专门为 高 3A’ 含量模板设计的测序试剂盒。 靠近引物的区域， 其测序信号可能由于引物峰遮盖而无 法阅读， 是 测 序 的 难 点。可 以 尝 试 加 入 /*% G（ $)) HH64 , I
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
DNA测序常见问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
基因组学研究中的高通量测序技术的使用中常见问题
基因组学研究中的高通量测序技术的使用中常见问题高通量测序技术是基因组学研究中的重要工具之一，它能够高效地测序大量基因组DNA或RNA序列。
然而，在使用高通量测序技术进行研究时，研究人员常常会遇到一些常见问题。
本文将介绍一些常见问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行基因组学研究。
常见问题1：质量控制与数据准确性在进行高通量测序时，质量控制和数据准确性是至关重要的。
测序数据质量不佳可能导致结果的不准确或不可靠。
解决方案：1.1 库构建过程中选择优质的DNA/RNA样品，并避免使用低质量的样品。
1.2 使用质控工具（例如FastQC）分析测序数据的质量，并对低质量区域进行去除或修复。
1.3 在数据分析过程中，根据测序数据的质量分数，筛选并过滤掉低质量的序列。
常见问题2：数据处理与分析高通量测序技术产生的数据量巨大，数据处理和分析是一个复杂且耗时的过程。
许多研究人员在这个阶段遇到困难。
解决方案：2.1 使用合适的数据处理工具，如Trimmomatic和Cutadapt，进行质量过滤和去除接头序列。
2.2 选择适合的序列比对工具，如Bowtie、BWA或STAR，将测序数据与参考基因组比对。
2.3 使用专业的分析软件，如DESeq2或edgeR，进行差异表达分析。
2.4 学习使用常见的基因组学研究工具和基因数据库，如Ensembl或NCBI，以寻找相关基因注释和功能信息。
常见问题3：错配率和假阳性结果高通量测序技术中存在着一定的错配率，这可能会导致假阳性结果的出现，从而影响研究结果的可靠性。
解决方案：3.1 对于临床研究，选择合适的错配率阈值，并使用相关软件（例如VarScan、GATK或SAMtools）来识别和过滤由错配率引起的假阳性。
3.2 在实验设计中添加技术重复，并使用统计分析方法来验证结果，以减少假阳性的可能性。
常见问题4：分析结果的解释高通量测序技术产生的数据量大，数据分析结果丰富，但可能也会带来解释上的困难。
DNA测序常见故障排除
2
软件问题：Annotation窗口
SeqAnalysis 3.7 (3100) SeqAnalysis 5.1 (3730)
3
硬件问题：状态EPT窗口
电流、电压、温度、激光功率
电流是否平稳：放电、气泡 过高、过低：缓冲液、气温
4
化学问题：Electropherogram
峰形是否正常 高度：150~1500点 宽度：半峰宽 形态：对称 信噪比、杂带 序列长度
C C T T T TG T T CG G A AC A T A AG G T T T AA G A A AC AC AC AC AC G T T T TC TG G G G TC T C T T G T T AG AT G T A A A TG T G C G G C AT C C AG A CG C T T AC T A T G C AG T G T A AG C T C AG T TG G T T T AC 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610
40
模板过量
41
模板与引物不平衡
质 粒 模板 : 引物 = 200 ng : 3.2 pmol PCR产物 模板 : 引物 = 10 ng : 3.2 pmol
42
测序失败的图谱
• 正常范围：150 ~ 1500 • 信号太高：进样太多 • 信号太弱：反应差，数据不可靠 如果基线清楚，也能获得好数据
C C A AC TG AG A T A A T A A AG C A AA C AA T A AC AT T TG AT C A TG A T G TC T AC G A G A T AA TG TG C CC G G C AA AG TT C T T T A G G AA TT G T AA TG A GA A A GA G AGTGGAA TT G G GT C AT AATT T C T C TT C 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850
DNA测序中的一些常见问题和对策
2 结果2.1 成功的建立HSV-1致死性感染动物模型,HSV感染滴度为106ID50/0.1ml。
死亡小鼠各组织器官涂片上HSV抗原均呈阳性反应,表明小鼠死于HSV感染。
2.2 空白对照组小鼠100%健康存活,致死攻击组小鼠100%发病死亡。
多于感染后第4～5天出现茸毛、抽搐、下肢麻痹等脑炎症状,5～7d内死亡。
M cAbS被动免疫实验组对小鼠均有保护作用。
第3、4组小鼠全部存活21d以上,第5组于感染后第15天发生1只鼠死亡,其余全部存活。
于感染后24d将第1,3,4,5组小鼠人工处死。
以上表明HSV-1 M cAbS对HSV-1致死性感染的小鼠几乎100%有特异性保护治疗作用。
另外,致死攻击组小鼠各组织器官涂片HSV 抗原均呈强阳性,其余各组与对照组为阴性。
表明小鼠感染HSV后,发生病毒血症导致死亡。
3 讨论HSV属于疱疹病毒科的具有代表性的典型疱疹病毒,其核酸为线状双股DNA。
有两种血清型:HSV-1和HSV-2。
两型病毒的DNA有50%的同源性,因此有型间共同抗原,也有型特异性抗原。
HSV病毒体有6种与细胞膜相关的糖蛋白,分别为糖蛋白B(g B)、gC、gD、g E、gG和g H。
其中gB、g D 与病毒感染的吸附及穿入有关,gH与病毒释放有关[7]。
g D 是HSV-1和HSV-2的共同抗原决定簇,其抗gD抗体属中和抗体,中和病毒的能力最强,能与HSV的g D抗原特异结合,结果改变了病毒的表面结构,阻断了病毒对宿主细胞的吸附,使病毒失去了感染能力[8]。
本实验所用的M cAbS中既有能识别HSV的gB、g D抗原的型共同性特异性单克隆抗体,也有能识别HSV的g C的型特异性单克隆抗体,体外中和试验也证明其中和效价为105～107,具有很强的中和病毒的作用[9]。
本实验结果在观察期内,空白对照组100%存活,且HSV抗原呈阴性。
致死对照组100%死亡,HSV抗原呈强阳性,证实本组小鼠死于HSV感染。
DNA测序结果常见问题分析
DNA测序结果分析比对 - 测序图初识通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。
测序图的两端（本图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。
这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。
我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。
实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。
由于临床专业的研究生，这些东西是没人带的，只好自己研究。
开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。
实际比对了数千份序列后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面1～2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。
一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。
最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。
通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。
对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。
DNA测序常见问题分析及解决办法
DNA测序常见问题分析及解决办法常见问题具体情况可能原因处理办法备注样品准备问题菌培养不好或失败抗性不对或菌体已死核对抗性，尽可能提供载体信息和新鲜菌液。
.菌培养条件特殊重新提供新鲜菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出或产量很低质粒拷贝数极低客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒，特殊情况请在测序订单上备注。
.培养方式不当自带质粒或已纯化PCR产物量极低是否为电泳法定量质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠总量是否足够测序出现双峰双峰重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复建议用反向引物测互补链。
此类问题主要与样品有关质粒测序在插入序列中出现套峰可能样品为非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱可能是存在移码突变，这是正常的，建议克隆后测序。
.PCR产物中一个或多个位置有套峰序列中存在突变，这是正常的，建议克隆后进行测序。
PCR产物测序前部分双峰引物二聚体污染或产物不纯，更换引物重新PCR或克隆后测序。
质粒测序时整个结果双峰引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。
重新合成引物测序。
信号信号迅速衰减或中断模板GC二级结构区后难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序模板GT二级结构区后测反向互补序列，AC结构不影响测序严重的重复结构测反向互补序列模板特性决定的根据具体情况决定信号极弱或无信号信号极弱或无信号模板质量差重新提供菌液或纯化PCR产物质粒样品：引物不符尽量提供载体详细信息，核查引物引物不适宜测序测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。
重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序质粒产量极低客户自己提供2ug纯化好的质粒PCR产物定量极低重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化测序结果正常，与预期不符找不到引物质粒模板检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
基因测序(PCR常见问题)
PCR常见问题PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
测序过程常见问题分析与解答
测序过程常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：（1）简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
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D N A测序结果中常见
的几个问题
公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别
这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂
由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列
如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点
可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事
首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果
序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别
原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
当然尽管我们有时做了最大努力，但还是保证不了和文献序列完全一致，但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。
8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别
PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先，PCR 扩增过程中可能产生错配。
将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非100%。
9 、有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！
如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。
测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。
只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体
的存在。
其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的，这样即使突变的模板所占的比例较高时，也不一定能准确检测到突变的存在，因为，测序仪是主要用来测序正常的碱基序列的，软件分析结果时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。
尊重结果，我们是不会人为将出现单一的信号修改为杂合位点的。
10 、 DNA 测序样品用 TE 溶液溶解好不好
由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一种潜在的抑制物, DNA 的测序反应也是Taq 酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件,因此 DNA 测序样品溶解时，最好用灭菌水溶解。
11 、我送什么形式的菌体样品好
菌体的一般形态有、菌液，平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌等。
我们建议客户所送的形态以方便且不易受污染为准则，推荐穿刺培养菌。
上海客户用过夜培养好的菌液2 ml 。
12 、为什么你们给我的序列是反的
测出来的结果与您预期的方向并不一致,可能是片断插入方向是非定向的，这在 PCR 产物 T/A 克隆中较常见。
有时，客户要求的测序引物离克隆位点较近，如果反向引物相对克隆位点较远，为得到更好的结果，我们会选择反向引物测序，若是这种情况，用看图软件 Chromas 可以把图反转过来，就可得到正向序列。
13 、 Template mixed 为何种情况
测序结果表现为套峰，测序反应信号很好，测序结果杂乱,即同一个位置有二个峰。
原因可能有：样品并非单一模板、 PCR 产物中有杂带、质粒为双克隆产物、引物特异性不高，有两个结合点， PCR 产物电泳时看不出，但测序结果能清楚地说明这点。
14 、 polyT 或 polyA 后峰图杂，怎么也要收费
这种情况一般表现为 A 、 T 连续结构后面的测序结果出现套峰，是样品的内在原因。
这类问题我们应该同正常测序一样，给客户报告，反应按正常收费。
15 、我的引物做 PCR 条带很好，但为什么测不出序来
并不是能做 PCR 反应的引物都能测序，测序所用引物要求较高,必须与模板完全匹配（有时 5' 端可以有个别碱基的简并），引物长度一般为20个碱基左右、 GC 含量适中，而且用于测序的引物一定要足够纯。
16 、如果我的菌种培养得很好，测序应该不会有问题吧
对于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 α， DH1 、和 C600 菌株也可，XL1-Blue 菌株也不错，但其生长过慢。
JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列菌株等由于产生大量的碳水化合物（即糖），而应当尽量避免使用；其它宿主菌可能会对测序造成影响。
17 、为什么 G/C rich 的样品没结果或结果不好，照常收费
由于 G/C 连续结构有时会造成反应中途无法正常进行，如果结构在引物下游近处，反应只有一小段的信号，有时甚至反应根本没信号。
对于这种情况，本身就潜在不确定性的测序，有很大的失败因素。
18 、 PCR 产物150 bp 以下的为什么不适于直接测序
PCR 产物 150bp 以下的纯化和定量都有一定困难，用于测序的 PCR 产物一般不低于150 bp 长度。
一个150 bp 的 PCR 产物用于测序，去掉两个引物的序列大约40到50 bp ，再加上测序起始端的一些读不好的碱基，真正能够得到的有用序列不过几十碱基。
这只是最理想的假设，这么短片断测序失败的几率非常大，因此只能克隆后再进行测序。
19 、我的质粒样品很好，测序结果怎不好
由于原因不明的复杂结构如发卡和回文结构，有时会出现突然信号减弱或消失；有时测序根本不能进行下去， DNA 碱基排列并无特别异常，可能是 DNA 整体出现复杂结构，反应无法进行。
20 、我的样品还保留了吗我想现在反向再测一个反应。
出于保密原则我们测序样品只保留一个月，所以若要再测序，请抓紧时间，否则只有重新送样。
21 、已经测通了样品，但重叠的地方有错配，是为什么
测通的全序列是拼接后的结果，由于拼接处一般是在一次测序的末端和次个反应开始一段，通常会有一定的杂带，以序列信号好的为主，次的为参考，但也不绝对。
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