DNA测序分析常见问题整理
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精品课件
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不 要吸进注射器； – 样品纯化干净。
精品课件
有机物污染（瀑布效应）
● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
精品课件
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
wenku.baidu.com精品课件
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子
原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
精品课件
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
精品课件
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受 激发产生一定波长的荧光，抬高 基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗 或更换胶引导块、针筒。
精品课件
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
精品课件
Applied Biosystems 3730/3730xl
DNA Analyzers
DNA测序分 析常见问题 整理
精品课件
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A TCG
精品课件
影响测序质量的主要因素
• 引物 • DNA模板 • 纯化 • 困难模板 • 机器影响
精品课件
一、引物对测序结果的影响
割胶纯化
精品课件
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
精品课件
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
精品课件
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
精品课件
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
精品课件
四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
精品课件
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖， 有小突起
精品课件
精品课件
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
精品课件
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 ● 现象：每个峰前面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
精品课件
酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明” 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
精品课件
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
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模板上没有引物结合位点
● 现象：没有特异性的 测序峰图 ● 原因：引物无法结合 模板 ● 对策 重新设计引物
精品课件
引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常 （引物二聚体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净 ● 对策：割胶纯化
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双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
特殊结构
精品课件
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
精品课件
高GC
Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰精。品课件
重复序列
GT 重复导致信号衰减
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二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
精品课件
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
精品课件
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不 要吸进注射器； – 样品纯化干净。
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有机物污染（瀑布效应）
● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
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引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
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非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子
原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
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三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
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染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受 激发产生一定波长的荧光，抬高 基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗 或更换胶引导块、针筒。
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四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
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测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A TCG
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影响测序质量的主要因素
• 引物 • DNA模板 • 纯化 • 困难模板 • 机器影响
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一、引物对测序结果的影响
割胶纯化
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点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
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移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
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杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
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A/G重复导致信号衰减 或信号乱
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
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四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
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毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖， 有小突起
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① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
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合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 ● 现象：每个峰前面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
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酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明” 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
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荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
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模板上没有引物结合位点
● 现象：没有特异性的 测序峰图 ● 原因：引物无法结合 模板 ● 对策 重新设计引物
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引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常 （引物二聚体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净 ● 对策：割胶纯化
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双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
特殊结构
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Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
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高GC
Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰精。品课件
重复序列
GT 重复导致信号衰减
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二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
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正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
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终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序