DNA测序常见问题分析及解决办法
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DNA测序常见问题分析及解决办法
常见
问题
具体情况
可能原因
处理办法
备注
样品
准备
问题
菌培养不好或失败
抗性不对或
菌体已死
核对抗性，尽可能提供载体信息和新鲜菌液。
菌培养条件特殊
重新提供新鲜菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
或产量很低
质粒拷贝数极低
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒，特殊情况请在测序订单上备注。
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量
极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。重新合成引物测序。
信号
信号迅速衰减或
中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
不收
300bp以后中断或衰减
高级结构GC结构重复序列
收
双克隆
收
引物在模板上有多结合位点
收
模板不纯
收
引物与模板非特异性结合
收
菌液中存在杂菌
收
引物与模板结合不好
收
模板中有碱基缺失
收
非特异性条带
收
套峰
非单克隆、杂合子、双引物结合、Poly结构、PCR非特异性扩增
收
3kb以上walking测序，按实际反应收费，或成功反应1.5倍价格收费
收
客户提供引物导致测序结果不理想
引物不纯
收
质粒抽提成功率60%以下（大单）
质粒太大或活化方式不好、转化不好
质粒抽提不成功的，加收3元/质粒
验证实验结果，两次结果
一致
收2次费
不一致
收1收费
PCR原液纯化后
无反应结果
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
收纯化费
不收测序费
3、以质粒为模板进行PCR扩增目的基因实验，不保证扩增的结果与参考序列完全一致。
4、以下情况下只发E-mail不提供测序报告：经检测不合格样品；没有反应信号；信号极其杂乱；出现重叠峰形，无法得到有用信息。
关于什么情况收费，什么情况不收费的约定
尊敬的客户：
您好！北京标凯感谢您的支持！北京标凯将以规范的测序流程，成熟的测序技术为您服务，测序平均成功率90%。
结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
关于DNA测序服务的说明
1、如需TA克隆后测序，提供PCR产物的量不少于50ul。我们在收到样品后，先进行回收纯化，再进行克隆实验。
2、目的基因亚克隆实验，请提供含有目的基因的质粒及亚克隆载体质粒，如果质粒量少请提供保存菌种，我们需要额外收取转化或质粒提取费用。我们在收到样品后，先进行预实验检测，检测结果与背景资料一致时开始实验。
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减wk.baidu.com
高级结构GC结构重复序列
PCR除外
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠
总量是否足够
测序出现双峰
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
测反向互补序列，AC结构不影响测序
严重的重复结构
测反向互补序列
模板特性决定的
根据具体情况决定
信号极弱或无信号
信号极弱或无信号
模板质量差
重新提供菌液或纯化PCR产物
质粒样品：
引物不符
尽量提供载体详细信息，核查引物
引物不适宜测序
测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序
大家知道，测序结果是否理想除了规范化得流程外，还有很多因素，样品是很关键的因素。测序没有信号不收费；但是，由于样品本身的原因或是样品前期处理不好导致信号不好我们是收费的。为了减少争议，我们总体做一个事先约定作为解决问题的办法，从长远来说我们认为是公道的，这样还可增强友谊。
具体约定如下：
北京标凯科技有限公司测序服务收费准则
建议用反向引物测互补链。
此类问题主要与样品有关
质粒测序在插入序列中出现套峰
可能样品为非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
可能是存在移码突变，这是正常的，建议克隆后测序。
PCR产物中一个或多个位置有套峰
序列中存在突变，这是正常的，建议克隆后进行测序。
PCR产物测序前部分双峰
引物二聚体污染或产物不纯，更换引物重新PCR或克隆后测序。
常见
问题
具体情况
可能原因
处理办法
备注
样品
准备
问题
菌培养不好或失败
抗性不对或
菌体已死
核对抗性，尽可能提供载体信息和新鲜菌液。
菌培养条件特殊
重新提供新鲜菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
或产量很低
质粒拷贝数极低
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒，特殊情况请在测序订单上备注。
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量
极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。重新合成引物测序。
信号
信号迅速衰减或
中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
不收
300bp以后中断或衰减
高级结构GC结构重复序列
收
双克隆
收
引物在模板上有多结合位点
收
模板不纯
收
引物与模板非特异性结合
收
菌液中存在杂菌
收
引物与模板结合不好
收
模板中有碱基缺失
收
非特异性条带
收
套峰
非单克隆、杂合子、双引物结合、Poly结构、PCR非特异性扩增
收
3kb以上walking测序，按实际反应收费，或成功反应1.5倍价格收费
收
客户提供引物导致测序结果不理想
引物不纯
收
质粒抽提成功率60%以下（大单）
质粒太大或活化方式不好、转化不好
质粒抽提不成功的，加收3元/质粒
验证实验结果，两次结果
一致
收2次费
不一致
收1收费
PCR原液纯化后
无反应结果
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
收纯化费
不收测序费
3、以质粒为模板进行PCR扩增目的基因实验，不保证扩增的结果与参考序列完全一致。
4、以下情况下只发E-mail不提供测序报告：经检测不合格样品；没有反应信号；信号极其杂乱；出现重叠峰形，无法得到有用信息。
关于什么情况收费，什么情况不收费的约定
尊敬的客户：
您好！北京标凯感谢您的支持！北京标凯将以规范的测序流程，成熟的测序技术为您服务，测序平均成功率90%。
结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
关于DNA测序服务的说明
1、如需TA克隆后测序，提供PCR产物的量不少于50ul。我们在收到样品后，先进行回收纯化，再进行克隆实验。
2、目的基因亚克隆实验，请提供含有目的基因的质粒及亚克隆载体质粒，如果质粒量少请提供保存菌种，我们需要额外收取转化或质粒提取费用。我们在收到样品后，先进行预实验检测，检测结果与背景资料一致时开始实验。
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减wk.baidu.com
高级结构GC结构重复序列
PCR除外
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠
总量是否足够
测序出现双峰
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
测反向互补序列，AC结构不影响测序
严重的重复结构
测反向互补序列
模板特性决定的
根据具体情况决定
信号极弱或无信号
信号极弱或无信号
模板质量差
重新提供菌液或纯化PCR产物
质粒样品：
引物不符
尽量提供载体详细信息，核查引物
引物不适宜测序
测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序
大家知道，测序结果是否理想除了规范化得流程外，还有很多因素，样品是很关键的因素。测序没有信号不收费；但是，由于样品本身的原因或是样品前期处理不好导致信号不好我们是收费的。为了减少争议，我们总体做一个事先约定作为解决问题的办法，从长远来说我们认为是公道的，这样还可增强友谊。
具体约定如下：
北京标凯科技有限公司测序服务收费准则
建议用反向引物测互补链。
此类问题主要与样品有关
质粒测序在插入序列中出现套峰
可能样品为非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
可能是存在移码突变，这是正常的，建议克隆后测序。
PCR产物中一个或多个位置有套峰
序列中存在突变，这是正常的，建议克隆后进行测序。
PCR产物测序前部分双峰
引物二聚体污染或产物不纯，更换引物重新PCR或克隆后测序。