DNA测序常见问题分析及解决办法

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。

为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。

N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。

该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。

有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。

在序列的3’端易产生N值。

一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。

一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。

测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。

这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。

测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。

有两种方法可以得到引物序列。

1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。

对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。

载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。

DNA测序技术的使用中常见问题

DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。

然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。

本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。

1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。

低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。

常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。

解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。

- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。

- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。

2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。

然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。

解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。

- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。

3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。

然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。

解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。

选择合适的方法来检测特定类型的突变。

- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。

- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。

4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结

结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱

DNA测序结果中常见的几个问题

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

DNA测序分析常见问题整理

二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子原因：挑克隆时两个质粒混在一起对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器； – 样品纯化干净。
有机物污染（瀑布效应）
合成时部分引物多一个碱基
合成时部分引物少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。

DNA测序中的一些常见问题和对策

其抗 <+ 抗体属中和抗 $%&’# 和 $%&’! 的共同抗原决定簇，体，中和病毒的能力最强，能与 $%& 的 <+ 抗原特异结合，结果改变了病毒的表面结构，阻断了病毒对宿主细胞的吸附，
［@］使病毒失去了感染能力。本实验所用的 5678% 中既有能
识别 $%& 的 <;、也有 <+ 抗原的型共同性特异性单克隆抗体，能识别 $%& 的 <= 的型特异性单克隆抗体，体外中和试验也证明其中和效价为 #( 2 #( ，具有很强的中和病毒的作用
［$， %］序，都存在下列问题。
点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化，注意纯化后要进行电泳检测。 # 测序信号提前共同终止，测序反应无法继续进行
［@］、常见原因：模板 !"# 中有二级结构形成 8"?& 浓度不
当或模板浓度过大，导致测序反应提前终止。对策：一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题，若为自制试剂，可予替换或重新配制，再重复实验。由于测序反应要求模板必须为单链，所以对于二级结构形成导致的测序反应共同终止，可以提高模板变性温度使之充分分解为单链，或加入甲酰胺使模板变性充分、彻底。 $ 无正常测序信号常见原因：引物设计不当或模板 3A’ 含量过高。对策：测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者是针对不同克隆载体设计的引物，一般不会存在上述问题。特异性引物是指与模板特异性且唯一性结合的引物，设计原则如下：（$）引物长度 ! $= .B，一般 %)%C .B；（ %） 3A’ 含量 ! 一般为 C)D<)D （；@）避免引物自身形成互补；（ E） C)D ， @F 末端为 3 或 ’ 更为合理。模板 3A’ 含量过高者可采用专门为高 3A’ 含量模板设计的测序试剂盒。靠近引物的区域，其测序信号可能由于引物峰遮盖而无法阅读，是测序的难点。可以尝试加入 /*% G（ $)) HH64 , I

DNA测序结果中常见的几个问题

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事? 首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别？原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

DNA测序常见问题分析及解决办法

结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
关于DNA测序服务的说明
1、如需TA克隆后测序，提供PCR产物的量不少于50ul。我们在收到样品后，先进行回收纯化，再进行克隆实验。
2、目的基因亚克隆实验，请提供含有目的基因的质粒及亚克隆载体质粒，如果质粒量少请提供保存菌种，我们需要额外收取转化或质粒提取费用。我们在收到样品后，先进行预实验检测，检测结果与背景资料一致时开始实验。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠
总量是否足够
测序出现双峰
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。重新合成引物测序。
信号
信号迅速衰减或
中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。

为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。

N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。

该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。

有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。

在序列的3’端易产生N值。

一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。

一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。

测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。

这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。

测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。

有两种方法可以得到引物序列。

1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。

对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。

载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。

测序常见问题分析与解答

测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。

DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。

如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。

的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。

如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。

提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。

PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。

3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。

我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。

平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。

这样既误时间，又浪费客户的样品。

一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。

而甘油保存菌则容易污染。

制作穿刺菌时，可在1。

5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。

穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。

应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

DNA测序分析常见问题整理

实用文档
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子
原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
实用文档
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
实用文档
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
Applied Biosystems 3730/3730xl
DNA Analyzers
DNA测序分析常见问题整理
实用文档
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A TCG
实用文档
影响测序质量的主要因素
• 引物 • DNA模板 • 纯化 • 困难模板 • 机器影响
实用文档
一、引物对测序结果的影响
实用文档
A/G重复导致信号衰减或信号乱
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
实用文档
四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
实用文档
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖，有小突起
实用文档
实用文档
割胶纯化
实用文档
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
实用文档
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
实用文档
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
实用文档

DNA测序中的一些常见问题和对策

2　结果2.1　成功的建立HSV-1致死性感染动物模型,HSV感染滴度为106ID50/0.1ml。

死亡小鼠各组织器官涂片上HSV抗原均呈阳性反应,表明小鼠死于HSV感染。

2.2　空白对照组小鼠100%健康存活,致死攻击组小鼠100%发病死亡。

多于感染后第4～5天出现茸毛、抽搐、下肢麻痹等脑炎症状,5～7d内死亡。

M cAbS被动免疫实验组对小鼠均有保护作用。

第3、4组小鼠全部存活21d以上,第5组于感染后第15天发生1只鼠死亡,其余全部存活。

于感染后24d将第1,3,4,5组小鼠人工处死。

以上表明HSV-1 M cAbS对HSV-1致死性感染的小鼠几乎100%有特异性保护治疗作用。

另外,致死攻击组小鼠各组织器官涂片HSV 抗原均呈强阳性,其余各组与对照组为阴性。

表明小鼠感染HSV后,发生病毒血症导致死亡。

3　讨论HSV属于疱疹病毒科的具有代表性的典型疱疹病毒,其核酸为线状双股DNA。

有两种血清型:HSV-1和HSV-2。

两型病毒的DNA有50%的同源性,因此有型间共同抗原,也有型特异性抗原。

HSV病毒体有6种与细胞膜相关的糖蛋白,分别为糖蛋白B(g B)、gC、gD、g E、gG和g H。

其中gB、g D 与病毒感染的吸附及穿入有关,gH与病毒释放有关[7]。

g D 是HSV-1和HSV-2的共同抗原决定簇,其抗gD抗体属中和抗体,中和病毒的能力最强,能与HSV的g D抗原特异结合,结果改变了病毒的表面结构,阻断了病毒对宿主细胞的吸附,使病毒失去了感染能力[8]。

本实验所用的M cAbS中既有能识别HSV的gB、g D抗原的型共同性特异性单克隆抗体,也有能识别HSV的g C的型特异性单克隆抗体,体外中和试验也证明其中和效价为105～107,具有很强的中和病毒的作用[9]。

本实验结果在观察期内,空白对照组100%存活,且HSV抗原呈阴性。

致死对照组100%死亡,HSV抗原呈强阳性,证实本组小鼠死于HSV感染。

DNA测序结果中常见的几个问题

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事? 首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别？原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

DNA测序常见问题及其分析-图文

DNA测序常见问题及其分析-图文测序常见问题及其分析CollectedbyRobertoRun,12.10.2022 HTUTUUUTTH1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。

如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、polyA/T和C/Gcluter导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

DNA测序结果常见问题分析

DNA测序结果分析比对 - 测序图初识通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。

测序图的两端（本图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。

这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。

我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。

实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。

由于临床专业的研究生，这些东西是没人带的，只好自己研究。

开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。

实际比对了数千份序列后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面1～2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。

一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。

最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。

通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。

对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。

DNA测序结果中常见的几个问题

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

DNA测序技术改进方法建议

DNA测序技术改进方法建议随着近年来生物技术的飞速发展和普及，DNA测序技术已成为生物科学研究和医学诊断领域的重要工具。

然而，目前的DNA测序技术还存在一些挑战和局限，需要改进和完善。

在这篇文章中，我将针对当前DNA测序技术面临的问题，提出一些建议和改进方法。

首先，现有的DNA测序技术中，尽管高通量测序技术已经取得了巨大进展，但其测序错误率仍然较高。

因此，改进测序准确度是一个至关重要的问题。

为此，我们可以采取以下措施：1. 引入错误校正算法：通过在测序过程中引入错误校正算法，例如使用基于质量值和碱基频率的算法，可以有效降低测序错误率。

此外，结合深度学习技术，可以提高错误校正的准确性和效率。

2. 优化DNA库的构建：当前DNA测序技术中，DNA库的构建对测序准确度至关重要。

因此，我们可以通过优化DNA库构建的化学反应条件、选择更高质量的DNA样品和适当的文库制备方法等方式来提高测序准确度。

其次，高通量测序技术尽管可以快速获得大量的测序数据，但其对于长DNA片段的测序仍然存在困难。

因此，我们需要采取一些措施，以提高长DNA片段的测序质量和效率：1. 引入第三代测序技术：第三代测序技术具有快速、高效和长读长等优势，可以克服短读长引起的重叠区域难以拼接的问题。

因此，引入第三代测序技术作为补充，可以有效提高长DNA片段的测序质量。

2. 优化测序反应条件：目前，DNA测序中常使用的链终止法和桥式扩增法在长DNA片段的测序中存在一定的局限性。

因此，我们可以通过优化反应条件，例如优化引物和酶的浓度和反应温度等，来提高长DNA片段的测序效率。

此外，DNA测序技术的高昂成本也是制约其广泛应用的一个重要因素。

为了降低测序成本，我们可以采用以下措施：1. 提高测序效率：通过优化测序反应条件，例如缩短反应时间和提高反应效率，可以提高单位时间内的测序数据产量，从而降低测序成本。

2. 推广经济实惠的测序平台：当前市场上已经出现了一些经济实惠的DNA测序平台，如小型台式测序仪等。

DNA测序结果中常见的几个问题

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事? 首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别？原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

DNA测序结果中常见的几个问题

当然尽管我们有1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有 20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下 ABI377 测序仪能正确读出 500 个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音（杂带）是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在 98%以上。