脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性_赵建辉
自从２００１年Ｚｕｋ等［１］人从抽脂脂肪中发现脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＳＣｓ）以来，关于ＡＳＣｓ的研究迅速增多，现已成为整形美容外科研究热点之一。
ＡＳＣｓ是一群成纤维细胞样的基质干细胞，能分化为不同的细胞系［２］，包括脂肪细胞［３］、骨细胞［４］、软骨细胞［５］、骨骼肌细胞［６］、心肌细胞［７］、内皮细胞［８］、神经细胞［９］等等。
ＡＳＣｓ不仅在整形外科应用于自体脂肪移植、创面愈合等，而且在心肌缺血、神经系统疾病、组织工程等领域中也有着广泛的用途。
Ｋｏｔａｒｏ等［１０－１４］从２００３年就开始采用细胞辅助脂肪移植术（ｃｅｌｌ－ａｓｓｉｓｔｅｄｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｒ，ＣＡＬ），将ＡＳＣｓ应用到自体脂肪移植隆胸和软组织填充中，取得了不错的临床效果。
随着研究的不断深入，ＡＳＣｓ将是很有临床应用前景的干细胞。
1材料和方法１．１实验材料１．１．１主要试剂：ＤＭＥＭ－ＨＧ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ），胰酶消化液（碧云天），Ⅰ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ），青－链霉素（Ｈｙｃｌｏｎｅ），苏木精（上海蓝季科技公司），曙红Ｙ（Ｓｉｇｍａ，ｗｏｌｓｅｎ分装），牛胰岛素（Ｓｉｇｍａ），吲哚美辛（Ｓｉｇｍａ），地塞米松（Ｓｉｇｍａ），β－甘油磷酸钠（Ｓｉｇｍａ），左旋抗坏血酸（科昊生物），３－异丁基－１－甲基黄嘌呤（Ｓｉｇｍａ），茜素红（天津科密欧），Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（碧云天）。
１．１．２主要仪器：细胞培养孵箱（Ｔｈｅｒｍｏ），超净工作台（江苏苏净集团有限公司ＳＷ－ＣＪ－１ＦＢ），台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司ＴＤＺ５－ＷＳ），空气恒温摇床（上海福玛实·基础研究··论著·人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性赵建辉１，李龙２，杨阳１，易成刚１，刁建升１，夏炜１，刘蓓１，郭树忠１（１．第四军医大学西京医院全军整形外科研究所陕西西安７１００３２；２．第四军医大学口腔医院口腔颌面外科）[摘要]目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＳＣｓ），对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。
脂肪组织干细胞的研究进展
脂肪组织干细胞的研究进展杨立业;黄天华【摘要】脂肪组织中存在多能的干细胞,在体外可以长期增殖,在一定的条件下能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞和平滑肌细胞,是一种新的组织工程和细胞移植的干细胞来源.本文综述了脂肪组织干细胞的培养、向多种方向分化和动物实验的研究进展.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)002【总页数】3页(P162-164)【关键词】干细胞;脂肪;分化【作者】杨立业;黄天华【作者单位】汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041;汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041【正文语种】中文【中图分类】R338.1组织工程的一个研究重点是种子细胞的来源问题，自体的多能干细胞应用到临床能够治疗疾病，造血干细胞是最早应用到临床的干细胞。
组织工程的一种细胞来源是骨髓基质，骨髓腔中含有几种细胞成分，包括间充质干细胞（mesenchyml stem cells，MSCs），它能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞，是目前骨和软骨组织工程的主要细胞来源[1]。
然而它的自体获得也受到一些条件的限制，并且一次骨穿获得的细胞数量有限。
另外一种潜在的自体干细胞来源是脂肪组织，它的获取可在局麻下进行，对病人的损伤较小。
脂肪来源的干细胞目前可称为脂肪来源的基质细胞（adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs），能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞和平滑肌细胞[2-6]。
人类、大鼠和小鼠的ADSCs细胞培养方法相同[1，4，6]。
首先，获取的脂肪组织用缓冲液反复冲洗，剪刀剪碎，0.075%的胶原酶37℃消化30～50 min，800 g离心10 min，沉淀成分为基质血管层（stromal vascular fraction，SVF），DMEM培养基重悬细胞，筛网过滤离心，弃上清。
人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究
・基础论著・文章编号 1007-9564(2006)11-1213-03人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究063000 河北省唐山市,华北煤炭医学院附属医院神经内科 叶新春 刘 斌 王瑞敏3关键词 人脂肪基质细胞;组织分离;细胞培养摘要 目的 探讨人脂肪基质细胞体外分离与培养,为其将来应用于组织工程提供基础。
方法 通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织,进行体外分离培养脂肪基质细胞,并在相差显微镜下每日观察、记录人脂肪基质细胞的生长状况,并用CCK-8测定其生长生活。
结果 人脂肪基质细胞呈现梭形外观,增殖旺盛,体外容易扩增。
结论 我们建立了一种自人体脂肪组织分离、培养人脂肪基质细胞简便稳定的方法,为其应用于组织工程提供了基础。
ISOLATION AN D CU LTIVATION OF HUMAN ADIPOSE-DERIVE D ADU LT STR OMA L CE LLS IN VITR O Ye X inchun, L i u B in,W ang R uimin.Department of N eurology,T he A f f iliated Hos pital of N orth China Coal Medical College,T an2 gshan063000,ChinaK ey w ords adipose-derived adult stromal cells;tissue isolation;cell cultureAbstract Objective To establish an approach for isolation and cultivation of human adipose-derived adult stromal (ADAS)cells in vitro.Methods The adipose tissue was obtained f rom the omentum of abdominal surgery patients under the aseptic condition,then it was isolated and cultured in vitro.The phase-contrast microscope was used to observe human adipose-derived adult stromal cells every day and the viability of human adipose-derived adult stromal cells was assessed by CC K-8.R esults Human adipose-derived adult stromal cells appeared as a monolayer of spindle-shaped,fibroblastic cells with active proliferation,and they can proliferated easily in vitro.Conclusion A simple and stable method for isolation and cultivation human adipose-derived adult stromal cells is successf ully established,which provides the foundation for fu2 ture usage of human ADAS cells in tissue engneering. 以美容为目的的脂肪组织切除术诞生于100多年前[1]。
骨组织工程研究的新进展:修复骨缺损的完美技术
骨组织工程研究的新进展：修复骨缺损的完美技术李凯【摘要】骨组织工程自20世纪80年代诞生以来,取得了飞速的发展,为临床上骨缺损的治疗带来新的希望.纵观骨组织工程研究的二十多年里,其构成的三大要素:种子细胞方面、支架材料方面和组织构建方面都取得了一定的进展.但是距离组织工程骨在临床中正式使用尚有一定距离,有待进一步的研究.本文就目前骨组织工程研究的现状及最新进展作一综述.%Bone tissue engineering has developed rapidly since the 1980s and brought new hope for the treatment of bone defects. Throughout twenty years, the three major elements of bone tissue engineering: seed cells, scaffolds and organizations to build have made great progress. However, there is still certain distance for tissue engineered bone to be used officially in clinic. In this paper, the current status of bone tissue engineering research and the latest developments are reviewed.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(009)018【总页数】3页(P15-17)【关键词】骨组织工程;骨缺损;研究进展【作者】李凯【作者单位】哈尔滨医科大学附属第三医院骨科,黑龙江哈尔滨150081【正文语种】中文【中图分类】R681.2临床上由于各种原因导致的骨缺损很常见，然而修复骨缺损的惟一方法是通过骨移植来实现。
脂肪干细胞的体外培养PPT讲稿
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下：
（1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的 梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞 （此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂 滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂 肪细胞。
Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细
胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自间 叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中的 含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正的 ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检
测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM 1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin，CD62)； b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体； c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、 Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)； d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45； f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白； g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用摘要：脂肪干细胞（ADSCs）属于间充质干细胞，可以从脂肪组织中分离获得，具有多向分化能力，在不同诱导液诱导下，能够分化为多种细胞，应用于临床治疗中。
本文结合以往学者研究，针对ADSCs分离、分化以及应用展开研究。
关键词：脂肪干细胞；分离培养；细胞分化；易学应用前言：ADSCs是通过脂肪组织提取的MSCs，如今技术研究逐渐深入，分离提取ADSCs的方法逐渐完善。
目前常见酶消化法、胶原酶、机械分离以及悬浮培养法等多种方法，提取ADSCs需要关注试剂、冻存试剂、离心转速以及传代代数等多个方面。
凭借其分化优势，在临床研究中受到了极大关注。
1 ADSCs的分离培养提取ADSCs的方法有多种，但目前广泛使用吸脂术提取脂肪，在无菌环境中制作脂肪粒，将血管以及结缔组织剔除后，进行包膜。
使用Ⅰ型胶原酶在恒温环境中消化处理1h。
停止消化后，设定1800r/min离心速度，获取基质血管成分，使用过筛网过滤至培养皿中进行培养。
经过换液传代后，可以获得ADSCs样本。
冻存液配比1:4:5的DMSO：含胎牛血清培养液：胎牛血清，使用程序降温法冻存，保存温度为-80℃最好[1]。
2 ADSCs的分化ADSCs分化能力强大，在不同环境中，能够分化为不同胚层源细胞，分别为内胚层、中胚层以及外胚层。
2.1 内胚层第一，分化为肝细胞样细胞，通过无血清培养ADSCs后，使用HGF、烟酰胺以及bFGF 继续培养2周，可以促进ADSCs诱导为肝细胞样细胞。
使用HGF、FBS、FGF配置诱导液，经过3周诱导后，能够检测出肝细胞标志物，证明能够诱导为肝细胞样细胞。
第二，分化为胰岛细胞。
有学者使用烟酰胺、激活素、HGF等配置诱导液，进行ADSCs培养，经过15d诱导，可检测到胰岛素基因蛋白以及促进因子，证明成功诱导分化为胰岛样细胞[2]。
2.2 中胚层首先分化为心肌细胞，有研究指出，在氮杂胞苷的诱导下，可推动ADSCs分化为心肌细胞，由于氮杂胞苷也存在一定毒性，需要寻找有效试剂取代氮杂胞苷。
郑州大学远程教育医学基础本科试述骨组织4种细胞的结构特点及功能
试述骨组织4种细胞的结构特点及功能骨祖细胞是骨组织的干细胞，位于骨外膜及骨内膜贴近骨的表面，体积小，呈梭形，弱嗜碱性。
当骨组织生长或改建时，能分化为成骨细胞。
成骨细胞分布于骨组织表面，胞体有细小突起，矮柱状或椭圆形，胞质嗜碱性。
电镜下可见大量的粗面内质网和高尔基复合体。
成骨细胞合成和分泌骨基质的有机成分，形成类骨质。
成骨时，成骨细胞还释放基质小泡。
泡内有细小的钙化结晶，是钙化的起始部位。
成骨细胞分泌类骨质后被包埋于其中，便成为骨细胞。
骨细胞位于骨板内或骨板间，胞体较小，有许多细长突起，胞体呈扁椭圆形。
胞体所在的腔隙称骨陷窝；突起所在的腔隙称骨小管。
骨细胞的结构和功能与其成熟度有关。
刚转变的骨细胞与成骨细胞相似，仍能产生类骨质。
随着类骨质逐渐钙化为骨质，细胞逐渐变为成熟的骨细胞。
体积变小，细胞器减少，突起延长，相邻骨细胞的突起以缝隙连接相连，骨小管彼此相通。
骨陷窝和骨小管内含有少量组织液。
骨细胞具有一定的溶骨和成骨作用，参与调节钙、磷平衡。
破骨细胞数量少，主要分布于骨组织的边缘，是一种多核的大细胞，直径30~100μm，含有6~50个核。
目前认为它由多个单核细胞融合而成，无分裂能力。
胞质为嗜酸性，细胞器丰富，尤以溶酶体和线粒体居多。
功能活跃的破骨细胞有明显的极性，光镜下可见破骨细胞贴近骨基质的一侧有皱褶缘。
电镜下呈许多大小和长短不一的突起。
胞质内含多种水解酶和有机酸，溶解骨盐，分解骨有机成分。
表明破骨细胞具有很强的溶骨和吸收能力。
骨组织工程中成骨细胞有四种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织，其中以骨髓为最优。
因为骨髓基质细胞具有多向分化潜能，因此有必要选择最佳的培养条件来促进其增殖并定向分化为成骨细胞。
可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的，其中以BMP、b-FGF和TGF-β的作用最为显著和直接。
也可将各种生长因子的基因转入骨髓基质细胞，使其稳定有效地表达，通过自分泌和旁分泌作用来达到同样的目的。
脂肪来源的间充质干细胞及外囊泡促成骨分化的研究进展
1672V ol.40 No.12 Dec. 2020上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE )综述近年来，我国骨质疏松症患病率逐渐攀升。
一项最新研究[1]显示，我国骨质疏松症的总患病率为13%，总人数已超过1.78亿。
老年人是骨质疏松症的重点人群，自1982年起，我国65岁以上老年人占人口比重不断升高，2019年我国65岁以上老年人占人口比重已达到12.6%[2]。
预计到2050年，我国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[1]。
骨质疏松症使得骨质脆性增加、易于骨折，导致患者的生活水平急剧下降。
利用脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells ，ADMSCs ）诱导成为成骨细胞治疗骨质疏松症是医学研究的新方向[1]。
ADMSCs 可以通过旁分泌功能，分泌一些生物活性分子，为组织修复建立良好的微环境，促进新生血管的形成和伤口愈合，并且减少组织的炎症反应。
ADMSCs 也可分泌促进血管生成和抗凋亡潜能的生长因子，如转化生长因子（transforming growth factor ，TGF ）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor ，IGF ）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF ）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor ，HGF ）[3]和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein ，BMP ）家族BMP-2、BMP-7等[4]。
ADMSCs 来源丰富，通过脂肪抽吸术易于获得，无免疫排斥。
平均每300 mL 脂肪组织可获得108个 细胞，每克动物脂肪可获得5 000个成纤维集落形成单位（colony forming unit-fibroblast ，CFU-F ）[5]。
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红;张阳春;张常然;杨兴【摘要】背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。
<br> 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。
<br> 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。
选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。
选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
<br> 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。
②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。
③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。
④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。
%BACKGROUND:Adipose-derived stem cels are a kind of mesenchyam stem cels with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cels in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cels from human subcutaneous adipose tissues folowed byin vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. <br> METHODS: Adipose-derived stem cels were isolated from human subcutaneous adipose tissue andcultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cel morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cels at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cel counting kit-8 method, and then cel growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cels underwentosteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. <br> RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cels can be successfuly isolated from human adipose tissues.(2) The growth process of human adipose-derived stem cels includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cels. Moreover, the population doubling time is shorter. (3). Human adipose-derived stem cels are positive for stem cel-related antigens, with low immunogenicity and the multi-differentiation potential. (4) Labeling human adipose-derived stem cels with DAPI is a simple efficient labeled method, and the labeling rate is high but the cytotoxicity is low【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)032【总页数】7页(P5155-5161)【关键词】干细胞;脂肪干细胞;人来源的脂肪干细胞;细胞分化;脂肪组织;细胞培养;细胞鉴定;国家自然科学基金【作者】肖建红;张阳春;张常然;杨兴【作者单位】中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及成骨诱导分化
大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及成骨诱导分化【摘要】目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的方法及成骨能力。
方法: 通过密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,检测细胞表面标志、定向成骨分化和细胞矿化作用。
结果: 原代培养大鼠骨髓基质干细胞通过3~5代传代,细胞形态趋于一致,诱导条件下出现矿化结节。
结论:大鼠骨髓基质干细胞体外培养可模拟成骨分化过程,可作为骨组织工程研究的细胞学模型。
【关键词】骨髓基质干细胞;诱导分化;成骨细胞【中图分类号】r414.1【文献标识码】b【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells, bmscs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。
本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。
材料和方法1 材料1.1 实验动物。
成年wistar 大鼠,雌雄不限,体重150~180 g ,由浙江大学华家池动物实验中心提供。
1.2 实验试剂。
胎牛血清,胰蛋白酶(hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),b一甘油磷酸纳(sigma,usa),地塞米松(sigma,usa),维生素c(sigma,usa),小鼠抗大鼠oc单克隆抗体(r-d,usa),兔抗大鼠cd4(ba0532)、cd44(ba0321)、cd54(ba0541)、cd105(ba1725)、fibronectin(ba1772)、collagen ⅰ(ba0325)、egfr1(b0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)2 方法2.1 bmscs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%fbs的高糖dmem培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。
脂肪细胞的基础知识
脂肪细胞的基础知识脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。
它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。
前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。
全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。
生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。
细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。
此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。
张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44.脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。
前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。
张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.间充质干细胞概念：不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。
干细胞分类和定义
干细胞分类和定义
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可以分化为多种不同类型的细胞。
根据干细胞的来源、分化潜能和功能，干细胞可以分为以下几类：
1. 全能干细胞：全能干细胞具有发育成为完整个体的潜能，可以分化为所有类型的细胞。
例如，胚胎干细胞就是一种全能干细胞。
2. 多能干细胞：多能干细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，但其分化能力有限，不能发育成为完整的个体。
例如，骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等属于多能干细胞。
3. 专能干细胞：专能干细胞只能分化为一种或少数几种特定类型的细胞，例如神经干细胞、造血干细胞等。
4. 诱导多能干细胞：诱导多能干细胞是通过基因重编程技术将成体干细胞或其他细胞转化为类似于胚胎干细胞的多能干细胞。
干细胞的定义是指一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可以产生多种不同类型的细胞，并且在维持组织和器官的稳态和修复方面发挥重要作用。
干细胞的研究对于再生医学、药物研发、疾病治疗等领域具有重要意义。
通过对干细胞的研究，我们可以探索细胞分化和发育的机制，开发新的治疗方法，为许多疾病的治疗提供新的思路和途径。
需要注意的是，干细胞的研究和应用仍面临一些伦理和法律问题，需要在科学、伦理和法律的框架下进行。
骨再生的研究进展
骨再生的研究进展刘守应;王继芳;蔡谞【期刊名称】《中华保健医学杂志》【年(卷),期】2014(016)001【总页数】4页(P67-70)【关键词】骨;再生;移植;组织工程【作者】刘守应;王继芳;蔡谞【作者单位】100853北京,解放军总医院骨科;100853北京,解放军总医院骨科;100853北京,解放军总医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R68骨骼是一种高度血管化并受神经支配的结缔组织，处于一种连续不断的更新及重建过程中，其独特的再生能力属损伤修复反应的一部分［1］。
骨再生由一系列协调的骨传导和骨诱导的生物过程所组成，新形成的骨与周围正常的骨骼没有区别［2］。
在临床中，常见的骨再生形式是骨折愈合，创伤、肿瘤切除、感染、骨骼发育异常、缺血性骨坏死及关节置换翻修等造成的骨缺损［3］。
临床应用自体骨移植、同种异体骨移植和牵张成骨促进或加强骨再生，新的方法有组织工程和基因治疗，系统性增加骨修复的方法［4］。
以及增强骨形成的辅助物理治疗手段，如低频脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）、脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMF）等。
1 骨移植骨移植是最常用的促进骨再生的方法，包括自体骨移植、同种异体骨移植和异种骨移植等。
1.1 自体骨移植自体骨移植是临床常用的、成功率最高的修复骨缺损的方法。
自体骨是最理想的骨移植材料，具有骨移植所要求的骨诱导性、成骨性和骨传导性，同时组织相容性好且无免疫原性。
自体骨可取三面皮质骨作为结构支撑，或作为吻合血管移植物来修复巨大骨缺损以及缺血性坏死［5］。
全身多个部位均可作为移植骨的取材部位，如髂骨、胫骨、肋骨和腓骨等；另外，还可以在邻近手术区局部取骨，如应用梨状肌筋膜骨瓣治疗股骨颈骨折。
最近，有人利用钻吸系统（reamer-irrigator-aspirator，RIA）将髓腔作为一个取骨部位，以提供大量自体骨［6］。
小鼠骨髓和脂肪间充质干细胞定向分化能力的比较研究
实验研究小鼠骨髓和脂肪间充质干细胞定向分化能力的比较研究钟家帅，冯玉梅△摘要：目的探讨小鼠骨髓源性间充质干细胞（BM-MSCs）和脂肪源性间充质干细胞（AD-MSCs）的定向分化能力。
方法从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs，分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导两种细胞定向分化。
采用茜素红、阿利新蓝和油红O染色检测成骨、成软骨和成脂分化程度；实时荧光定量PCR（qPCR）鉴定MSCs并检测定向分化相关基因Runx2、Sp7（成骨），Sox9、Col2a1（成软骨），Pparg和Cebpa（成脂）表达水平，确定细胞的定向分化能力。
基于GEO数据库中GSE43804和GSE122778数据集的小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱数据，分析差异表达基因及其富集的信号通路。
结果分离培养得到的BM-MSCs和AD-MSCs细胞形态不同，AD-MSCs梭形形态更明显；两种细胞均表达CD29、CD44和CD90，不表达CD34和CD45。
定向诱导后AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成软骨分化程度低于BM-MSCs （P＜0.05）；定向诱导后AD-MSCs中Runx2、Pparg和Cebpa mRNA表达水平高于BM-MSCs，Sox9mRNA表达水平低于BM-MSCs（P＜0.05）。
小鼠和人的AD-MSCs高表达的基因富集于PPAR和WNT信号通路，BM-MSCs高表达的基因富集于软骨和骨发育信号通路。
结论小鼠AD-MSCs成骨和成脂分化能力强于BM-MSCs，而成软骨分化能力弱于BM-MSCs，PPAR、WNT、软骨和骨发育信号通路的活化状态在决定BM-MSCs和AD-MSCs不同定向分化潜能中起重要调节作用。
关键词：间质干细胞；骨髓；脂肪类；PPARγ；Wnt信号通路；成骨分化；成软骨分化；成脂分化中图分类号：R329.24文献标志码：A DOI：10.11958/20230437Comparative study on the directed differentiation ability of mouse bone marrow andadipose-derived mesenchymal stem cellsZHONG Jiashuai,FENG Yumei△Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer;Tianjin's ClinicalResearch Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Department of Biochemistry and Molecular Biology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin300060,China△Corresponding Author E-mail:**************.cnAbstract:Objective To investigate the targeted differentiation ability of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells(BM-MSCs)and adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs).Methods BM-MSCs and AD-MSCs were isolated and cultured from bone marrow of femur and white adipose tissue of groin of C57BL/6J mice respectively,and the two types of cells were induced by osteogenic,chondrogenic and adipogenic differentiation medium respectively.Alizarin red,alcian blue and oil red O staining were used to detect the differentiated degree of osteogenic,chondrogenic and lipogenic differentiation.Real-time fluorescence quantitative PCR(qPCR)was used to identify MSCs and detected expression levels of directed differentiation-related genes Runx2,Sp7(osteoblast),Sox9,Col2a1(chondroblast),Pparg and Cebpa(lipogenesis)to determine the directed differentiation ability of cells.Based on gene expression profiles of mouse and human BM-MSCs and AD-MSCs in GEO database GSE43804and GSE122778,the differentially expressed genes and their enrichment signal pathways were analyzed.Results The cell morphology of BM-MSCs and AD-MSCs obtained by isolation and culture was different,and spindle-shaped morphology was more obvious in AD-MSCs.Both cells expressed CD29,CD44and CD90,but did not express CD34and CD45.AD-MSCs showed higher osteogenic and lipogenic differentiation than those of BM-MSCs after directed induction,while chondrogenic differentiation was lower in AD-MSCs than that of BM-MSCs(P＜0.05).After directional induction,expression levels of Runx2,Pparg and Cebpa mRNA were higher in AD-MSCs than those in BM-MSCs,and Sox9mRNA expression levels were lower than those in BM-MSCs(P＜0.05).Highly expressed genes of AD-MSCs in mice and human were enriched in PPAR and WNT signaling pathways.Highly expressed genes of BM-MSCs were基金项目：天津市医学重点学科（专科）建设项目（TJYXZDXK-009A）作者单位：天津医科大学肿瘤医院，国家恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所生物化学与分子生物学研究室（邮编300060）作者简介：钟家帅（1999），男，硕士在读，主要从事肿瘤分子生物学方面研究。
齐全组织胚胎学名词解释（3）
齐全组织胚胎学名词解释（3）齐全组织胚胎学名词解释▲内分泌腺:以腺上皮为主要成分构成的器官称腺,若形成的腺无导管,腺细胞的分泌物直接经血液或淋巴运输则称内分泌腺。
结构特点:腺细胞排列成索状、团状或围成滤泡；腺细胞周围有丰富的毛细血管；腺细胞能分泌高效能的活性物质，即激素。
▲基膜:又称基底膜,是位于上皮基底面与其深面结缔组织之间的一层薄膜，一般由靠近上皮的基板和与结缔组织相连的网板构成。
▲疏松结缔组织:又称为蜂窝组织。
其特点是细胞的种类较多,分散存在；纤维数量较少,排列稀疏,基质丰富,充填于纤维之间。
具有连接、支持、防御和修复的功能。
▲致密结缔组织:以纤维为主要成分,纤维粗大,排列致密。
主要功能是支持，连接和保护。
分为规则的致密结缔组织、不规则的致密结缔组织和弹性组织。
▲网状组织:由网状细胞和网状纤维构成。
网状细胞是一种有突起的星形细胞, 相邻的细胞突起相互连接成网。
▲异染性:染色后所呈现的颜色与所用染料颜色不同的特性。
▲分子筛:结缔组织基质以透明质酸为支架,结合许多大分子蛋白质,蛋白质上连着许多硫酸软骨素等多糖侧链,形成具有许多多孔隙的立体构型；具有阻挡大分子物质、细菌及异物通过的功能。
▲组织液:组织液从毛细血管动脉端渗入基质中的液体,经毛细血管静脉端和毛细淋巴管分别回流入血液和淋巴。
▲肥大细胞:细胞体较大,呈圆形或椭圆形,胞质内含有粗大的颗粒和白三烯、组胺、肝素等物质,多见于小血管周围结缔组织内。
▲软骨陷窝:软骨基质为半固态凝胶,软骨细胞在软骨基质中所占的腔隙称为软骨陷窝。
▲软骨囊:软骨基质由纤维成分和基质组成,软骨陷窝周围基质所含硫酸软骨素较多,HE 染色呈强嗜碱性,形似囊状,包围软骨细胞,称软骨囊。
▲同源细胞群:从软骨周边向软骨中央,软骨细胞逐渐成熟,体积逐渐增大,变成圆形或椭圆形,常成群分布,而且多以 2～8 个细胞聚集在一起,它们由一个软骨细胞分-裂增殖而来,称同源细胞群。
▲骨单位:以中央管为中心,呈同心圆方式排列着4～20层骨板,是长骨骨干中主要起支持作用的主要结构单位。
脂肪干细胞成骨分化的研究进展
脂肪干细胞成骨分化的研究进展摘要：骨组织工程研究的深入发展下，脂肪干细胞等多类型种子细胞出现在医学视野中。
脂肪干细胞作为脂肪组织中的细胞，具有诸多优势，是骨组织工程研究的核心内容之一。
为发挥脂肪干细胞优势及促进骨组织工程发展，本研究对脂肪干细胞成骨分化进行综述。
关键词：脂肪干细胞；成骨分化；骨组织工程间充质干细胞作为干细胞的核心组成部分，来源于发育早期的中胚层，是多能干细胞。
脂肪干细胞存在于脂肪当中，具有十分优异的多向分化功能，属于成体干细胞。
在特定条件下，脂肪干细胞具有软骨、内皮细胞等分化能力。
值得一提的是，脂肪干细胞具有创伤小且来源广的优势，同时兼顾免疫力强的特点，是间充质干细胞不具备的优点。
另一方面，脂肪干细胞的分离及培养流程较为简单，仅需要对一些脂肪组织进行剪碎消化离心处理。
脂肪干细胞增殖速度较快，可源源不断的提供细胞组织。
现有研究显示，脂肪干细胞获取量是间充质干细胞的五百倍，所以脂肪干细胞在骨组织工程具有巨大潜力。
脂肪干细胞虽然有诸多优势，让易受多类因素影响而影响其成骨分化能力。
大量学者从影响因素入手，探寻脂肪干细胞成骨能力影响因素，让其具备更加优异的临床性能。
本研究旨在了解不同分化手段的不同机制对脂肪干细胞的影响，对脂肪干细胞成骨分化机制及方法等进行综述。
1 诱导脂肪干细胞成骨分化方式1.1细胞共培养法细胞共培养法就是将至少两类细胞放置在统一环境中进行培养。
细胞共培养法的优势是可以反应细胞在环境中的作用关系。
Correia通过研究发现，将实验大鼠体内的脂肪干细胞装到由多种元素组成的胶囊内，同时将血管内皮细胞混入其中，随后将胶囊培养在不存在骨诱导因子的内皮细胞培养液中，这个时候脂肪干细胞可以分化为骨细胞，原因是胶囊在成骨分化过程中发挥着血管内皮生长因子的功能。
Lin等人认为，兔子的脂肪干细胞和成骨细胞培养在浓度为百分之五和百分之十的牛血清培养溶液中，可以发现经过七天诱导后兔子的脂肪干细胞转化为圆形，半个月后茜素红经过染色后呈现为阳性，原液为碱性的磷酸酶经过染色后也呈现为阳性。