脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

脂肪干细胞运用

A D S C s的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1200r ／min离心5～10min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm接种于50ml培养瓶内。37℃条件5％的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。 ADSCs的生物学特性 1.ADSCs的鉴定

在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。 ADSCs分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2C。 2.ADSCs的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3～异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin(瘦素)、Glut4(葡

脂肪干细胞的提取及鉴定

脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一)

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植

骨髓间充质干细胞研究进展(一)

骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一

骨髓基质干细胞及其应用的研究进展

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9

MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理

骨髓基质干细胞临床研究进展

２００９年２月第６卷第４期 骨髓基质干细胞临床研究进展 ?研究进展? 钦斌１。蔡建平２‘ （１．南京中医药大学２００２级中西医结合七年制研究生，江苏南京２１００２９；２．无锡市中医院，江苏无锡２１４０００） 【摘要】随着细胞研究的发展，骨髓基质干细胞的临床应用越来越受到重视。本文对骨髓基质干细胞的生物学特性、取材、分离、培养、临床前期研究成果和面临的问题进行了综述。 【关键词】骨髓基质干细胞；生物学特性；取材；分离；培养；临床应用 【中图分类号】Ｒ３２９．２【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７３－－７２１０（２００９）０２（ａ）一０１１—０２ １８６７年．Ｃｏｈｎｈｅｉｍ首先提出了骨髓内含有骨髓基质干细胞（ＭＳＣｓ）的观点；而Ｆｒｉｅｄｅｎ—ｓｔｅｉｎ于１９６６年首先发现。它是骨髓基质的组成成分。能分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。骨髓是由造血干细胞和非造血干细胞组成的器官，非造血干细胞（即ＭＳＣｓ）由骨前体细胞、软骨前体细胞、脂肪前体细胞、神经细胞和肌细胞前体细胞组成．因此。ＭＳＣｓ是由骨髓组织干细胞或前体细胞和躯体组织干细胞组成的成分及功能复杂的细胞群体『Ｉ】。许多年来，ＭＳＣｓ基础研究和临床应用的前期研究取得了重大进展．但是仍有许多问题尚待解决。 １细胞形态 ＭＳＣｓ具有３种细胞形态：①梭形细胞；②巨大扁平细胞；③体积非常小的球形细胞１＂２１。 ２生物学特性 ＭＳＣｓ有以下生物学特性：①自我更新能力。ＭＳＣｓ在体内具有很强的自我更新能力，是传代细胞１３１。②很强的黏附性。体外培养收集细胞时ＭＳＣｓ容易与骨髓基质分离形成细胞悬液，体外低密度培养时ＭＳＣｓ迅速黏附。反复冲洗可与非黏附的造血干细胞分离嘲。③可塑性。ＭＳＣｓ具有可塑性．即具有多向分化的潜能。骨髓脂肪细胞株在体内可分化为真正的骨组织［４１，骨髓网状细胞在体内可转变为脂肪细胞。在适宜的微环境下，ＭＳＣｓ可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、星形细胞、少突树突细胞及神经细胞等．而且能跨胚层分化，属于不同胚层的ＭＳＣｓ或前体细胞还能分化成与本身组织不相关的其他胚层组织．如骨髓中存在成肌细胞前体细胞，神经干细胞能重新分化成造血细胞．骨髓细胞分化为神经细胞和肝细胞［５－－１１。④快速增殖形成克隆的能力。ＭＳＣｓ能迅速产生单细胞源克隆。而且这些克隆均来源于单细胞克隆一克隆形成单位成纤维细胞（ＣＦＵ—Ｆ）隆７１。⑤可移植性。ＭＳＣｓ具有自我更新能力和可塑性。因此具备了可以移植的前提条件。一些临床前期研究表明ＭＳＣｓ移植可治疗某些疾病。３生物学特性的改变 ＭＳＣｓ在体内骨髓微环境下生长并保持特有的生物学特 【作者简介】钦斌（１９８３－），男，江苏无锡人，南京中医药大学２００２中西医结合七年制研究生。 。通讯作者性，但经体外适宜环境条件下培养后，许多生物学特性发生改变。①“归巢”能力丧失。大多数研究表明，原代ＭＳＣｓ体外培养并输注移植后。在受体中不能检测到或只能部分检测到供体的ＭＳＣｓ嗍。②分化潜能丧失。ＭＳＣｓ体外培养后．有的失去分化成脂肪细胞的能力．有的失去分化成软骨细胞和成骨细胞的能力１９．ｔ０１。③细胞形态异质性丧失。原代ＭＳＣｓ具有细胞形态的异质性，但经过一定时间的体外培养（传代３次）。形态的异质性逐渐丧失，细胞形态主要为巨大扁平细胞ｆｌｌｌ。 ④细胞融合入或核融合。当人ＭｓＣ８与热休克损伤的上皮细胞共同培养时。部分细胞直接转化成上皮细胞而与其他细胞或上皮细胞融合变成双核细胞且表达上皮细胞表面抗原¨２１。细胞融合人或核融合的机制和生物学意义目前尚未明确。 ４细胞的采集和培养 ＭＳＣｓ的取材一般采用骨髓穿刺法，操作方便。刨伤小。可反复取材而不影响细胞活力及机体功能。分离骨髓基质细胞的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞分选术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ．ＦＣＭ）。贴壁筛选法经济方便但纯化程度有限，有待进一步改进。密度梯度离心法得到的细胞纯度可达９５％ｔ１３】。流式细胞分选术可根据ＭＳＣｓ与造血细胞的表面标记的不同。用带有荧光标记的抗体从混合细胞群中获取高纯度的ＭＳＣｓ。ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＩｎｅ．用表面分子ＣＤｌ０５、ＣＤｌ６６、ＣＤ２９、ＣＤ４４阳性和ＣＤｌ４、ＣＤ３４、ＣＤ４５阴性筛选法得到几乎完全纯化的ＭＳＣｓ［ｔ，ｑ。 静态单层培养法是目前较为经典的细胞培养方法。这种方法简便易操作，成本低廉；缺点是培养细胞数量受培养器皿底面积限制，且不符合体内的生理环境。随着骨组织工程的研究。构建功能性组织工程骨已成为理想目标．进而对种子细胞的培养提出了更高的要求。生物反应器的使用使得ＭＳＣｓ的体外动态培养环境更接近于体内．从而使种子细胞功能形状等各方面更加完善。有研究表明，运用灌流式生物反应器不但可以进行多组织培养．而且还可以获得４．２２ｘ１０７／ｍｌ的细胞密度，长时间培养仍能保持细胞的多分化特性嗍。 ＭＳＣｓ体外培养需要种子数量较大。使用常规的培养方法往往需要长时间培养、多次传代才能完成。微载体培养法旧 ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬＨＥＲＡＬＤ巾一医嚣导■” 万方数据

自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究

自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究 目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型，随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），三个实验组均可明显促进大鼠运动功能和损伤后组织结构的恢复，其中联合组效果更显著。结论：骨髓基质干细胞移植联合EPO具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复。 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的神经系统损伤，其致残率和病死率均较高。目前，脊髓损伤在临床治疗后神经功能的恢复效果不甚理想[1-5]，急需改进，所以，脊髓损伤的治疗一直是医学研究的热点问题[6-7]。骨髓基质干细胞（MSCs）具有高度增殖和向多种细胞分化的潜能，可分化为对神经递质敏感且具有神经电生理特性的细胞，还可以产生多种神经生长因子促进受损的神经纤维修复，移植后可促进脊髓损伤的修复[8]，而且可以自体移植，因此骨髓基质干细胞是治疗脊髓损伤的理想种子细胞[9-10]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种由肾脏产生的内分泌激素，一直作为治疗贫血的药物而应用于临床。随着人们对EPO研究的深入，EPO已被证实是一种新型的神经保护和营养因子，具有神经营养和神经保护作用[11]。本实验将骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用于脊髓损伤大鼠，探讨骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用是否有协同效应。 1 材料与方法 1.1 实验材料和设备成年雄性SD大鼠80只，体重200～240 g；8周龄雄性SD大鼠4只，体重约100 g（均由哈尔滨医科大学动物试验中心提供）。二氧化碳细胞培养箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（日本奥林帕斯公司），低温离心机（德国Heraeus公司），单人双面净化工作台（苏州净化）超纯水净化器（美国Millipore公司），DMEM培养基，Percoll分层液。 1.2 实验方法 1.2.1 建立脊髓损伤模型与分组8周龄的SD大鼠用于骨髓基质干细胞的分离、培养和纯化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯卧位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范围内进行剪毛消毒。沿正中线切一3 cm长的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分针剥离肌肉，用骨钳咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓损伤打击器打击制成SCI模型。造模的标准是：脊髓出现出血、水肿、后肢迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动。冲洗切口后局部使用青霉素，以防感染，缝合后放回鼠笼喂养。按随机的方式将80只SCI模型的大鼠分为对照组、骨髓基质干细胞应用组、促红细胞生成素应用组和联合应用组，每组20只。对照组每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔注射相同量的生理盐水。骨髓基质干细胞治疗组将每只鼠采取尾静脉注射的方法在脊髓损伤后给予第3代培养的骨髓基质干细

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分 化的潜能等特点，已经成为干细胞研究领域的热点，是最好的组织工程种子细胞之一，还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。 [Abstract] Bone marrow stromal cells has derived simple，fast growth，the training process remains much to differentiate and other characteristics，has been become the hot spot in the study of stem cells，is one of the best seed cells of tissue engineering.It can also differentiate into neural cells.The article reviewes the progress of induction of bone marrow stromal cells to neural cells and its mechanisms. [Key words] Bone marrow stromal cells；Neural cells；Bone marrow 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）位于骨髓中，是具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞[1]。由于BMSCs具有取材容易、培养简单、增殖能力强、可以传代并且不改变生物学特性以及没有伦理学及免疫排斥等优点而备受瞩目[2-3]，BMSCs为治疗中枢神经系统疾病的一种理想供体细胞[4-6]。本文将BMSCs诱导分化为神经细胞的研究现状作一综述。 1 BMSCs定向分化为神经细胞的研究现状 1.1 体内定向分化 大量研究表明，BMSCs在体内可以分化为神经细胞。有学者将来源于人的BMSCs注入小鼠纹状体内，5～72 d后发现，在脑组织切片上有供体细胞存在，同时无明显炎症反应和排斥反应[7]。Mezey等[8]进行了雄性和雌性小鼠BMSCs 移植实验，将雄性小鼠的BMSCs植入雌性小鼠体内，一段时间后进行检测发现有携带Y染色体的神经细胞出现在雌性小鼠体内，提示雄性小鼠的BMSCs在雌性小鼠的体内分化成神经细胞。Guillermo等[9]将BrdU标记的大鼠BMSCs注入胎龄为15 d的大鼠胚胎的侧脑室内，在胎龄18、20 d时检测发现移植的细胞形成细胞团，2个月时检测仍有少量的移植细胞存活，表明BMSCs可以在脑的微环境中分化为神经细胞并存活较长时间。Chen等[10]将BMSCs应用于脑外伤动物，发现其能分化为神经细胞，并对神经功能的恢复有明显的促进作用。上述实验表明，BMSCs在体内可以迁移、存活、在相应部位的微环境影响下可分化为神经细胞，并能发挥一定的神经修复功能。 1.2 体外定向分化 能在体外分化为有较完整功能的神经细胞，是BMSCs作为神经细胞移植的来源细胞应用于临床的基础，很多学者在如何诱导BMSCs分化为神经细胞方面做了大量有益的探索，取得了较大进展，截止目前，诱导方法大致可归纳为以下

脂肪干细胞运用

ADSCs的分离与纯化 关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90 min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1 200 r／min离心5～10 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm 接种于50ml培养瓶内。37℃条件5％的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。 ADSCs的生物学特性 1.ADSCs的鉴定 在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期

的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。 ADSCs分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。 2.ADSCs的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3～异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin(瘦素)、Glut4(葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂肪细胞形成的标志。 向血管内皮细胞分化：将ADSCs置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一CD31和vW 因子。Planat等描述了将培养3d的ADSCs注入后肢缺血损伤的实验小鼠后

小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点

干细胞培养基的选择 研究背景： 小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。问题应该出现在培养基配方上。陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。 解决方案： 百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。 选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014） 实施步骤： 1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材； 2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液； 3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好； 4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。 结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。目前已经传至20代。对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。 案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。

脂肪组织源性干细胞研究进展

?小专论?脂肪组织源性干细胞研究进展3 李惠侠　屈长青　罗　肖　杨公社△ (西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100) 摘要　增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪 组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂 肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组 织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化 潜能、应用前景及存在的问题。 关键词　脂肪源性干细胞;细胞分化;组织工程 中图分类号Q81 白色脂肪组织在哺乳类动物整个生命过程中始终处于动态变化之中,不仅在机体整个能量调节中发挥重要作用,而且在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制中占有重要地位[1]。随着组织工程的迅速发展,Zuk等[2]2001年首次从人脂肪组织中发现了大量类似于干细胞的细胞,这些细胞在合适诱导剂的作用下可向成骨、软骨、脂肪和成肌等细胞分化。这样,对脂肪组织的研究不再局限于脂肪细胞。这些具有多向分化潜能的干细胞被称为脂肪组织源性干细胞(adi pose2derived ste m cells,ADSCs)。 一、AD SC s的发现 2001年以来,随着脂肪基质细胞分离和培养技术的完善,人们发现脂肪组织中除了能向脂肪与脉管细胞分化的细胞外,还存在着一些与骨髓间充质干细胞(bone marr ow mesenchy mal ste m cells,BM2 SCs)相似的具有多向分化能力的细胞。不同文献中,分别命名为抽脂处理细胞(p r ocessed li poas p irate cells,P LA),脂肪基质微管碎片细胞(str omal2vas2 cularfracti on cells,S VF),脂肪组织源基质细胞(adi2 pose2tissue derived str omal cells,ATSCs),脂肪源中胚层干细胞(adi pose2derived mes oder mal ste m cells, ADMSCs)等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。Guilak等(2006)分离了人S VF细胞,然后通过细胞表面标记选择单一来源的ADSCs,传4代单克隆培养扩增细胞。出现45个克隆时在特异性诱导剂诱导下,发现可以向成脂、成骨、软骨和神经原细胞等分化。其中成骨分化率为48%,软骨43%,神经元细胞占52%,12%为脂肪细胞。进一步证明了ADSCs确实有多向分化潜能,是一类重要的成体干细胞。目前已经证实从人、鼠、猪及兔子等不同物种脂肪组织中均可获得这种细胞,本文通称这种细胞为ADSCs。 二、AD SC s的优点及分子标记 从人类医学角度讲,获取ADSCs比BMSCs容易,给患者带来的痛苦小。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术,其安全性高。其次,脂肪组织比骨髓中所含的间充质干细胞(mesenchy mal ste m cells, MSCs)比率大。成纤维细胞集落形成单位(fibr o2 blast oid2like col onies,CF U2F)试验表明,脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍[3]。我们以鼠和猪为实验动物,胶原酶消化获得大鼠腹股沟及仔猪肩胛部ADSCs,体外培养观察到ADSCs为梭形、呈平行排列;经过多次传代,细胞增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例少,表明脂肪组织蕴含丰富的ADSCs。最后,从经济和社会效益看,从脂肪组织中获取ADSCs可将原本认为是废弃物的脂肪,如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后废弃的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源,具有极大的经济与社会效益。 一般认为ADSCs与BMSCs具有相似的生物学特性。ADSCs和BMSCs均表达4种通用多向分化潜能干细胞标记CD105、ST RO21、CD166及CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体,在全能或多能 3国家重点基础研究发展计划(973计划)(2004CB117506)资助课题 △通讯作者

脂肪干细胞运用

ADSC s 的分离与纯化关于ADSCS勺获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS夜冲洗干净后，用0. 1%的胶原酶在37C下振荡消化48 90mi n,再用含10%胎牛血清的等体积DME培养基终止。1200r /min离心5~10min,弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4X 105/cm接种于50ml培养瓶内。37C 条件5%的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70%?8O%融合时用0. 25%胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大,随后细胞体积渐增大,克隆形成。经传代后,细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物, 因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第 3 代时,可达95%以上的细胞纯度。 ADSCS勺生物学特性

ADSC s 的分离与纯化1. ADSCS的鉴定

在ADSCS鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44 OCT一4，E—eadherin ，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSC具有遗传稳定性。 ADSC分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）胎盘生长因子（PGF）、转化生长因子一B（TGF- B）、成纤维细胞生长因子（FGF 一2）等，低表达的因子有Ang 一2C。 2. ADSCS的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、 吲哚美辛及1 一甲基一3?异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCS向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin（瘦素）、Glut4（葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂

大鼠的骨髓间充质干细胞提取

大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml