第四章 细胞融合及其应用讲课教案
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杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞 核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此 又叫做体细胞杂种。
2.基本原理 细胞质膜的特性 细胞膜融合的原理
质膜靠近， 质膜局部区域紧密粘连，磷 脂分子重排，形成细胞桥； 胞质融合， 细胞核融合。
3.细胞融合大致过程
1.相关概念：
合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞 的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的 细胞结构称为合胞体。
同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。
异核体（heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融 合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。
2.意义
❖ 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期 败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。 如：薯番茄、番茄薯
3. 细胞融合的类型
1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣 告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部 分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出 马铃薯的块茎。
后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄 和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地 上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”， 据说番茄的产量很高。
高Ca2+高pH清洗增加了质膜的流动性，大大提 高了融合频率。
蟾蜍血细胞融合实验
2.2 物理诱导融合
• 物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电 融合
显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去 核兔卵母细胞卵周隙中。
•电融合
原理：细胞处于不均一的交变电场，细胞极化
成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲 使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。
１９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄 首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产 生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；
植 物 细 胞 融 合 过 程
人 造 小 鼠 培 育 过 程 示
意
图
三、细胞融合方法 ❖ 细胞融合方法有哪些？试述其原理。
1. 融合材料
1.1植物或微生物原生质体的制备
1.2动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单 细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较 少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质 丰富的纤维组织、癌组织等。
• 在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标 都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,
融合频率达60%） 。
• 优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无 毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。
2.3 生物法—病毒法
疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒
仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液 病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。
PEG诱导融合原理
PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳 水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子 足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子 桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负 极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连;
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可 被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原 生质体融合;
进行了融合;1972年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一个 烟草种间体细胞杂交植株。）
• 该方法异核体形成频率低，0.1-4%。
2.1.2 高钙-高pH法：
首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植 物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了 烟草体细胞杂种（1973年，50mmol/L钙离子、 pH值10.5）。
第四章 细胞融合及其应用
第一节 细胞融合概述 第二节 细胞融合技术应用
第一节 细胞融合概述
什么是细胞融合？ 为什么要进行细胞融合？ 简述细胞融合的研究历史。
一、细胞融合的概念和意义
1.概念 细胞融合（cell fusion) 又称体细胞杂交（ somatic hybridization)，即在自然条件下或 用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或 两个以上的细胞合并形成一个细胞 或 使之分化再 生、形成新物种或新品种的技术。
2. 融合方法
诱导融合的方法种类：
化学诱导
离子诱导融合法； 高钙-高pH法； PEG（聚乙二醇）法。
物理诱导
离心振荡 显微操作 电融合
生物法
仙台病毒法
2.1 化学法
2.1.1离子诱导融合法：
• 常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、
氯化钙等。
• 钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝 聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。 （1970年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体
钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结 合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。
该方法高pH值对原生质体有害。 异种融合效率达10-35%(高国楠,1源自文库74)
2.1.3 PEG（聚乙二醇）法
• PEG是一种多聚化合物，分子量在200－ 20000之间，毒性小易操作。 • 用PEG法与高钙-高pH法结合:制备两亲本的 原生质体，并至合适密度（105个/ml）；将 PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃， 10－20分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液15分钟； 洗涤，收集细胞计算融合率。 • 融合促进剂:伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和 链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。
❖ 创造细胞质杂种
某些农艺性状如：细胞质雄性不育、 除草剂抗性等都是由细胞质控制的。
有性杂交中雄配子携带细胞质极少， 难以产生细胞质杂种；
细胞融合的杂种细胞质能够选择某 一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双 亲重组。
❖ 为遗传学研究提供新的手段。
如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的 发生等。
二、基本原理 ❖细胞融合的基本原理是什么？ ❖简述细胞融合的大致过程。
2.基本原理 细胞质膜的特性 细胞膜融合的原理
质膜靠近， 质膜局部区域紧密粘连，磷 脂分子重排，形成细胞桥； 胞质融合， 细胞核融合。
3.细胞融合大致过程
1.相关概念：
合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞 的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的 细胞结构称为合胞体。
同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。
异核体（heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融 合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。
2.意义
❖ 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期 败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。 如：薯番茄、番茄薯
3. 细胞融合的类型
1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣 告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部 分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出 马铃薯的块茎。
后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄 和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地 上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”， 据说番茄的产量很高。
高Ca2+高pH清洗增加了质膜的流动性，大大提 高了融合频率。
蟾蜍血细胞融合实验
2.2 物理诱导融合
• 物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电 融合
显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去 核兔卵母细胞卵周隙中。
•电融合
原理：细胞处于不均一的交变电场，细胞极化
成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲 使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。
１９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄 首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产 生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；
植 物 细 胞 融 合 过 程
人 造 小 鼠 培 育 过 程 示
意
图
三、细胞融合方法 ❖ 细胞融合方法有哪些？试述其原理。
1. 融合材料
1.1植物或微生物原生质体的制备
1.2动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单 细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较 少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质 丰富的纤维组织、癌组织等。
• 在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标 都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,
融合频率达60%） 。
• 优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无 毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。
2.3 生物法—病毒法
疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒
仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液 病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。
PEG诱导融合原理
PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳 水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子 足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子 桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负 极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连;
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可 被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原 生质体融合;
进行了融合;1972年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一个 烟草种间体细胞杂交植株。）
• 该方法异核体形成频率低，0.1-4%。
2.1.2 高钙-高pH法：
首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植 物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了 烟草体细胞杂种（1973年，50mmol/L钙离子、 pH值10.5）。
第四章 细胞融合及其应用
第一节 细胞融合概述 第二节 细胞融合技术应用
第一节 细胞融合概述
什么是细胞融合？ 为什么要进行细胞融合？ 简述细胞融合的研究历史。
一、细胞融合的概念和意义
1.概念 细胞融合（cell fusion) 又称体细胞杂交（ somatic hybridization)，即在自然条件下或 用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或 两个以上的细胞合并形成一个细胞 或 使之分化再 生、形成新物种或新品种的技术。
2. 融合方法
诱导融合的方法种类：
化学诱导
离子诱导融合法； 高钙-高pH法； PEG（聚乙二醇）法。
物理诱导
离心振荡 显微操作 电融合
生物法
仙台病毒法
2.1 化学法
2.1.1离子诱导融合法：
• 常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、
氯化钙等。
• 钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝 聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。 （1970年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体
钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结 合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。
该方法高pH值对原生质体有害。 异种融合效率达10-35%(高国楠,1源自文库74)
2.1.3 PEG（聚乙二醇）法
• PEG是一种多聚化合物，分子量在200－ 20000之间，毒性小易操作。 • 用PEG法与高钙-高pH法结合:制备两亲本的 原生质体，并至合适密度（105个/ml）；将 PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃， 10－20分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液15分钟； 洗涤，收集细胞计算融合率。 • 融合促进剂:伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和 链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。
❖ 创造细胞质杂种
某些农艺性状如：细胞质雄性不育、 除草剂抗性等都是由细胞质控制的。
有性杂交中雄配子携带细胞质极少， 难以产生细胞质杂种；
细胞融合的杂种细胞质能够选择某 一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双 亲重组。
❖ 为遗传学研究提供新的手段。
如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的 发生等。
二、基本原理 ❖细胞融合的基本原理是什么？ ❖简述细胞融合的大致过程。