枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程

目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程

范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定

责任人：

内容：

1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管

2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。

3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。

4.检测步骤：

4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。

4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。

4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

5.菌落计数： 5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。

5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。

5.3 若有两个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。

6、结果统计与计算

根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽孢杆菌外的其他菌种）。统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B ）和杂菌数（E ）。

6.1 有效活菌总数按式（1）计算；

A=10×B ×C ×5 (1)

式中：

A ——有效活菌总数，cfu/g

B ——菌落活菌数；

C ——稀释倍数。

6.2杂菌率按式（2）计算：

D=

×100……………………(2) 式中：

D ——杂菌率，%

E ——杂菌数。 E E+A