枯草芽孢杆菌实验报告

微生物技术综合实验

年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201

学号：**********

*名：***

指导老师：刘凤霞教授

日期：二零一三十月五号

目录

1实验目的及原理 (1)

1.1实验目的 (1)

1.2实验原理 (1)

2实验材料 (1)

2.1实验仪器 (1)

2.2实验试剂 (1)

2.3培养基 (2)

2.3.1 生长培养基 (2)

2.3.2鉴定培养基 (2)

2.3.3摇瓶培养基 (2)

3试验方法 (2)

3.1仪器的准备 (2)

3.2培养基的配置 (2)

3.3初步筛选及鉴定 (2)

3.3.1采集土样 (3)

3.3.2富集培养 (3)

3.3.3稀释分离、纯化 (3)

3.3.4初筛 (3)

3.4复筛及鉴定 (4)

3.4.1革兰染色 (4)

3.5酶活力的测定 (4)

3.5.1摇瓶培养 (4)

3.5.2酶液稀释 (4)

3.5.3酶液测定 (4)

4结果分析 (5)

4.1平板涂布分离 (5)

4.2平板划线分离 (5)

4.3初筛 (5)

4.4复筛 (5)

4.5摇瓶培养 (6)

4.6酶活力测定 (6)

5参考资料 (7)

6附录 (8)

微生物上游技术综合实验

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

1.实验目的及原理

1.1实验目的

（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。

（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。

（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。

（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。

（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。

1.2实验原理

选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。

2. 实验材料

2.1实验仪器

无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。

2.2 实验试剂

○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。

○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

准确加入2.00mL碘液储备液，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每天配制一次）。

○320g/L可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于250mL烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下加入约80mL沸水，继续加热煮沸至透明（20min），冷却后用水定容至100mL（此溶液需当天配制，存放冰箱备用）

○4pH6.0磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解定容至1000mL，配好后用酸度计校正其pH至6.0

○50.1mol/L盐酸溶液：量取9.4mL浓盐酸，用水稀释定容至1000mL。

草酸铵结晶紫番红碘液95%酒精无菌水香柏油吸水纸擦镜纸

2.3 培养基

2.3.1 斜面培养基

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g琼脂15~20g，自来水1000ml，pH 7.2~7.4

2.3.2鉴定培养基

可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20 g, 自来水1000ml，校正pH至7.2～7.4,

2.3.3摇瓶培养基

玉米粉2g，黄豆饼粉1.5g，氯化钙0.02g，硫酸镁0.02g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，柠檬酸钠0.2g，硫酸铵0.075g,(溶解后加)，校正pH值7.0 3.实验方法

3.1仪器的准备

①准备试管若干支，洗净晾干，其中7支各装9毫升蒸馏水（或自来水），上塞，10支一捆121度高压灭菌20-30分钟。

②培养皿若干个并洗净晾干，每5个一包，高压灭菌。

③移液管洗净塞上脱脂棉，用报纸条包好、捆扎高压灭菌。

④准备一个三角瓶装入自来水300-400毫升，上棉塞并用纸包好高压灭菌。

3.2培养基的配置

按各培养基配方配置培养基，并将生长培养基分装6支试管，上棉塞，放入大烧杯中待灭菌。其余的培养基分装入三角瓶内，上棉塞，包扎灭菌。

3.3初步筛选及鉴定

微生物上游技术综合实验

3.3.1采集土样

用无菌铲铲去表层5-10厘米，用无菌器具规范采取50-100克，装入无菌纸袋中并记录采集的时间、地点及植被情况等等。

3.3.2富集培养

将采集的土样称取5克，放入装有45毫升无菌水的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中于37度下培养10-20分钟。

3.3.3稀释分离、纯化

取装有9毫升无菌水试管5支，用记号笔编上10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7取已稀释成10-1土壤液，振荡后静置30秒，用无菌的移液管吸取1毫升土壤悬液加入10-2的无菌水试管中，并在试管内轻轻反复吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1毫升稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。并做9个平板，每个稀释度做3个。

用一支新的无菌移液管，由低浓度开始（10-3,10-4,10-5），从各试管土壤稀释液中各吸取1ml，对号注入生长培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀，每个浓度做三个平板（重复），倒置于37℃温箱中培养24到48小时。

培养后，挑选10-5梯度上的单菌落进行平板划线分离，共划四个平板，并进行编号1、2、3号，于37℃倒置培养24h。

3.3.4初筛

透明圈实验

将疑枯草芽孢杆菌用平板划线法接种于鉴定培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24-48h后，用胶头滴管将碘液直接滴于菌落周围，观察现象。阳性反应（淀粉被分解）菌落周围出现透明圈，呈紫色；阴性反应则无透明环，呈深蓝色。（透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低）。

3.4复筛及鉴定

革兰氏染色：

（1）涂片：左手持培养皿，右手持接种环，用接种环从培养皿中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。