枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点
枯草杆菌生产_淀粉酶的研究
１０科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ研 究 报 告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。
α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。
目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。
我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。
现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。
总产量上万吨。
近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。
但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。
本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。
１ 材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。
１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。
１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。
产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。
4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。
2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种在垃圾堆、陆地和淡水中常见的细菌，它可以合成淀粉酶，参与食品加工和制药等领域。
为了深入研究芽孢杆菌产淀粉酶的机制，本文旨在克隆和表达枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，为今后的更深入研究奠定基础。
研究中，我们首先从枯草芽孢杆菌的形态学特性中确定菌株，然后利用定点突变技术，以外源基因引入枯草芽孢杆菌，以达到调控基因表达的目的。
实验中，通过对枯草芽孢杆菌分离介质DNA的提取、限制性内切酶扩增以及后续的PCR扩增，我们能够从大量杂合DNA中克隆出淀粉酶基因的片段，然后进行终止密码子转录、酶切以及连接方面的实验，最终可以将淀粉酶基因克隆入宿主细菌质粒中，从而表达淀粉酶蛋白。
经过蛋白质免疫印迹分析，可以看到从枯草芽孢杆菌中克隆和表达的具有淀粉酶功能的蛋白质，在不同pH条件下具有较强的淀粉水解能力，与未经克隆表达的芽孢杆菌菌株相比，淀粉酶产量有了显著提高。
基于以上结果，我们总结出了枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达的技术方案，为今后的深入研究提供基础，也为特定乳酸菌淀粉酶防护剂的研发提供参考价值。
本文通过介绍枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达，探索了枯草芽孢杆菌淀粉酶的分子机制，证明了定点突变技术对淀粉水解能力的增强作用，为淀粉酶的进一步研究提供了可靠的技术手段。
未来，
我们将借助于新的基因技术等技术平台，进一步深入研究芽孢杆菌淀粉酶的功能、结构和稳定性，以期能更好地利用该酶的乳化作用，为食品加工和药物制造等领域提供支持。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.11 Jun．，2011
枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化
赵望锋 1，周 晶 2 （1．滨州学院经济与管理系，山东 滨州 256600；2．曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165）
收 稿 日 期 ：2010－12－03 基 金 项 目 ：山 东 省 优 秀 中 青 年 科 学 家 奖 励 基 金 项 目 （2008BS09011 ）；山 东 省 自 然 科 学 基 金 项 目 （2009ZRB01461 ） 作 者 简 介 ：赵 望 锋 （1981－），男 ，山 东 莱 芜 人 ，助 教 ，硕 士 ，主 要 从 事 微 生 物 生 态 学 教 学 和 研 究 ，（电 话 ）0543－3191175 （电 子 信 箱 ）
摘要：以枯草芽孢杆菌为试验菌株，采用液态培养基发酵，探讨枯草芽孢杆菌产 α－淀粉酶的最佳发酵条
件，分别对碳源、氮源、发酵时间、接种量、培养基初始 pH 进行单因素试验，在此 基础上对碳源浓度、氮源
浓度、接种量、培养基初始 pH 这 4 个因素进行了 L9（34）正交优化试验。 结果表明，葡萄糖优于其他碳源，
1 材料和方法
1．1 试验材料 1．1．1 菌 种 枯 草 芽 孢 杆 菌 分 离 自 山 东 省 曲 阜 市 污水处理厂。 1．1．2 培 养 基 种 子 培 养 基 为 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基；发酵培养基用牛肉膏蛋白胨液体培养基。 1．1．3 主要试剂和溶液的配制 磷酸氢二钠－柠檬 酸缓冲液 （pH 6．0）： 称取磷酸 氢二钠 （Na2HPO4· 12H2O）45．23 g、柠 檬 酸 （C6H8O7·H2O）8．07 g， 用 蒸 馏 水溶解并定容至 1 000 mL。 配好后用 pH 计校正。 质 量浓度为 2％的淀粉溶液：称取可溶性淀粉 2．0 g，用 少量蒸馏水调匀，徐徐倾入煮沸的水中，加热煮沸
枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究
淀 粉 酶活 力 。 果示 干表 １ 菌 体 生长 和 结 。
产 酶 的最 适 温 度 均 在 ３ ７℃。 度 高 于４ 温 ４℃
１ １ １菌种 枯 草芽孢 杆 菌（ ａ ｉ ｕ 菌体 生 长 和 酶 活 力 迅 速 下 降 。 ．． Ｂ ｃｌ ｓ ｌ （） ２ 培养 基 对 菌体 生 长 和 产 酶 的 影 响 ， 同在 最适 温 度 ３ ℃下 ， 同的 接 种量 、 同 ７ 相 相
枯草 芽孢 杆 菌在马 铃 பைடு நூலகம்
薯 固体 培养 基（ 简称Ｐ Ａ） ７ Ｄ 上３ ℃培养 １ ｈ ２ 后 ３ 结 论 １ ２ ２液体 种子 的制备 ．． １ ０ 三角瓶 ０ ｍＬ ０一淀粉 酶是 产量 在 ， 【 用途 广 的 酶制 剂 品种 之 一 ， 国 目前 枯草 杆 菌 ａ一 粉酶 是 我 淀
一
实 际 的 指导 意 义 。
津产Ｓ ０ ０ Ｈ６ ０ Ａ型） ３ 在２ ℃至４ ℃范 围内培养 ４ 枯草 芽孢杆 菌（ ａ ｉｕ ｕ ｔ ｉ ，６ 后 测定 Ｂ ｃ ｌｓ ｓ ｂｉ ｓ ３ ｈ ｌ ｌ）
一
般 可 由微 生 物 发 酵 产 生 ， 可 由植 物 和 也 动物提取 。 １材料和方法 目前 ， 业 生 产 上 都 以 微 生 物 发 酵 法 １ １实验材料 工 ．
１ ｈ ｎｆ ｒ ｓ ） ｉ ｅ ｉｏ ｍｕ 等 中分 离 得 到 了 耐 高 温的 １ ２实验方 法 ｃ ． ａ一 粉 酶 菌 种 。 就 国 内而 言 ， 己开 展 淀 但 虽
了耐 高 温 ａ一淀粉 酶 的 研 究工 作 ， 目前 仍 以 １ ２． ． １菌种 激活
使 用
适 培 养 时 间为 ３ ｈ。 ６
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。
实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。
2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。
3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。
4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。
适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。
一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。
5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。
可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。
6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。
7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。
一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。
根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。
8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。
可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。
9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。
实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。
2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。
3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。
4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。
5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。
总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。
产淀粉酶的枯草杆菌正交试验
产淀粉酶的芽孢杆菌正交试验一、实验目的在基础发酵试验的基础上，通过正交实验对芽孢杆菌的发酵条件进行优化，确定培养芽孢杆菌的最佳碳氮比的培养基配方。
二、实验原理采用正交实验的方法，通过改变碳源氮源的比例培养芽孢杆菌，就可找出芽孢杆菌的最佳碳氮比的培养基配方。
三、实验材料及仪器1、筛选出来的产淀粉酶芽孢杆菌。
2、菌种：从商丘师院土壤中分离出的产淀粉酶的芽孢杆菌3、种子培养基：蛋白胨1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化钠1 % , pH自然4、基础发酵培养基：蔗糖1 % ,蛋白胨1 % ,磷酸氢二钠0. 2 % ,磷酸二氢钠0. 2 % ,pH 7.05、仪器：控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、分光光度计、烧杯、玻璃棒、锥形瓶等四、实验步骤1、培养基的配制：称量：按下表培养基配方比例依次准确称取，放入烧杯中溶化：在烧杯中先加少许水，用玻棒搅匀，在石棉网上加热使溶化，再加水至所需的体积。
调pH：用Na OH 或HCl调pH至7.0加塞、包扎、灭菌。
2、菌种活化将保存的菌种转接到斜面培养基,37 ℃培养24 h ,备用。
3、种子液的制备取一环活化的菌种,接入装量为50 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中,37 ℃,180 r/ min 培养18 h。
4、摇瓶培养分别取1 mL 种子液,接入盛有50 mL发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2 % ,V/ V) 。
置摇床中,30 ℃振荡培养12 h ,转速为160 r/ min ,进行单因素和正交实验的发酵条件研究。
5、培养基的单因素实验碳源：分别用1 %葡萄糖、和麦芽糖等量替代基础培养基中的蔗糖制成培养基。
采用摇瓶发酵培养条件,12 h 后测定发酵液中的活菌含量以确定最佳碳源。
氮源：分别用1 %酵母浸出物、牛肉膏替代基础发酵液1 %的胰蛋白胨。
采用摇瓶发酵培养条件,12 h 后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳氮源。
6、正交实验设计将筛选出的最优的碳源、氮源2 个重要因素,选用2 因素3 水平正交表进行实验,以做进一步优化7、测定方法用分光光度计法测定菌体数五、结果分析根据所得结果，列表比较找出最佳培养方案，即为此芽孢杆菌的最佳碳氮比配方。
实验二 枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶
三、仪器和试剂
1、菌种：枯草芽孢杆菌
2、仪器耗材：恒温培养箱、冰箱、高压灭 菌锅、无菌操作台、摇床、托盘天平、分 析天平、电炉、白色搪瓷杯、三角瓶、量 筒、纱布、绳子、pH 试纸、玻棒等。
四、实验步骤
1、菌种：枯草杆菌（已活化好，每组1支）
2、培养基的准备： 3、工艺条件： 查资料，自行设计 查资料，自行设计
发酵结束时，显微镜检查每个发酵瓶是否污染，
若无污染合并发酵液并测定发酵酶活目的、实验原理、实验内 容、实验步骤、实验结果与分析，讨论， 参考文献。 实验中存在哪些问题，如何改进；若实验 结果偏差较大需认真分析原因。
实验二 摇瓶发酵生产α-淀粉酶
一、实验目的
掌握酶的发酵生产方式之——微生物发酵 产酶；
学习和掌握摇瓶培养的方法。
二、实验原理
微生物发酵法是实际生产中酶制剂制取的主要方 法。发酵生产中多用液体深层发酵法制备酶。
在进行大规模液体深层发酵法生产酶制剂之前， 必须首先在实验室对保藏的目的菌种进行活化和 扩大培养，制得生产种子。 扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一 定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进 行恒温培养。 摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的 一种模拟实验。
4、菌种的制备：将成熟的菌种斜面在无菌条件下 注入10 mL 的无菌水，振荡成均匀的孢子悬浮液， 同时测孢子浓度。 5、接种：待灭菌后的培养基冷却后，分别将以制 备好的孢子悬浮液接入培养基中，接种量为2 mL， 共接5 瓶（100ml/250ml瓶），做好标记。
四、实验步骤
固液分离：方法自定；
获得的澄清发酵液-18℃保存，可装入矿泉水瓶 子中，备下次实验使用。 发酵过程中pH、酶活力的动态变化（可以每隔12h 测定直到发酵结束）；其他指标？
枯草杆菌在淀粉液态培养基中生产α-淀粉酶的研究
淀粉酶 ， 当时仅无锡酶制剂厂独家生产 ， 年产量为
收 稿 日期 ：２ ｏ一 Ｏ ２ Ｏ７ ｌ一３
作者简介 ：徐顺利（ ９ ８ ）女 ， １５ 一 ， 副主任医师， 现主要从事 中西医 医学及食 品营养学研究。
通讯作者 ： 刘海 因， ， 男 副教授 ， 主要从事生物化学教学与科研 工作。
目前 ，工 业 生 产 上 主要 以微 生 物 发 酵 法 进 行
到上千个 ， 中约有 ４％一 ０ 其 ０ ５ ％的工厂生产 一 淀粉
酶 。总 产量上 万 吨。
近年来 ，国外生产耐热 一 淀粉酶发展较快 ， 己
从嗜热真菌、 高温放线菌 、 物特别是从嗜热细菌（ 嗜
热脂肪芽孢 杆菌 Ｂｓ ａ ｔ ｒ ｏｈｌ ｔ ．ｅｒ ｈ ｍ ｐ ｉｓ 和地 衣芽孢 ｔ ｏｅ ｕ 杆菌 Ｂ１ ｈｎ ｏｍｌ等 ） ． ｅ ｉｒ ｌ ｉ ｆ ￣ 中分离得到 了耐高温 的 一 ｃ
酶 。 经 实验 表 明 ： ２ 在 ３℃ 至 ４ ４℃ 内 ， 酶 最 适 培 养 温 度 为 ３ 产 ７℃； 草 杆 茵 在 淀 粉 液 态 培 养 基 中 ３ 枯 ７℃条 件 下 。 过 经 振 荡 培 养 ， 产 酶 最 适 淀 粉 水 组 成 为 淀 粉 ： ＝ ５ １ｏ 在 最 适 温 度 ３ 其 水 ７ ：０ ； ７℃ 下 ， 粉 ： ＝ ５１ｏ时 ， 适 培 养 时 阍 为 淀 水 ７ ：０ 最
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第 ４ 卷（ ３ 总第 １０ ） 徐顺利 等 枯草杆菌在淀粉液态培养基中 ４期 生产ｄ淀粉酶的 一 研究
本 文 就 枯 草杆 菌 在 淀 粉 培养 基 上 产 Ｑ 淀 粉 酶 一 做 一下 研究 ， 其对 在 以玉 米 （ 粉 含量为 ７ ％一 ５ 淀 ０ ７ ％） 或 大 米 （ 粉 含 量为 ８％一 ５ 主 要 原料 的发 酵 酿 淀 ０ ８ ％）
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验化学与生命科学学院摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。
通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。
关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。
通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
实验材料和方法一、实验材料：（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）（二）培养基：1、种子培养液葡萄糖 1%Tryptone(胰蛋白胨)：1%,Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。
2、产淀粉酶发酵培养液玉米粉 2 .0 %黄豆饼粉1 .5%CaCl 2 0 .02 %MgSO4 0 .02%NaCl 0 .25%K2HPO4 0 .2%柠檬酸钠0 .2%硫酸铵0 .075%Na2HPO4 0 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管二、实验1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。
2、种子斜面及种子液准备– A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。
– B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。
枯草杆菌α-淀粉酶的生产 -回复
枯草杆菌α-淀粉酶的生产-回复枯草杆菌是一种常见的土壤细菌，它具有广泛的生态功能和应用潜力。
其中，枯草杆菌所产生的α淀粉酶具有重要的工业应用价值。
本文将重点介绍枯草杆菌α淀粉酶的生产过程，并一步一步回答相关问题。
第一步：枯草杆菌的筛选和培养枯草杆菌存在于自然环境中，但数量相对较少。
因此，首先需要对土壤、水体等样品进行筛选，以获得富集了枯草杆菌的样品。
一般来说，筛选方法包括稀释平板法、滤膜法等。
将样品分别稀释后接种到富含淀粉的培养基上，通过观察形状、颜色等特征，选择出生长较好的菌落。
筛选获得枯草杆菌后，需要进行培养。
枯草杆菌的培养基一般包括有机氮源、无机盐和适度的碳源。
常用的培养基主要有液体培养基和固体培养基。
液体培养基的优点是便于大规模生产，而固体培养基适用于纯化和保存菌株。
第二步：对枯草杆菌的生理特性进行研究在获得培养好的枯草杆菌后，需要进一步研究其生理特性，了解其适宜生长条件和产酶规律。
主要考察的因素包括温度、pH、碳源和氮源等。
通过调整这些因素，可以获得最佳的生长条件，提高α淀粉酶的产量。
第三步：淀粉诱导条件的优化淀粉是枯草杆菌产生α淀粉酶的主要诱导物。
在培养基中添加适量的淀粉，并对其浓度、添加时间和添加方式等进行优化。
一般来说，较高的淀粉浓度和适当的诱导时间可以促进α淀粉酶的合成和分泌。
第四步：分离和纯化α淀粉酶枯草杆菌培养物中产生了大量的α淀粉酶，但还同时存在其他杂质和细胞碎片等。
因此，需要对培养物进行分离和纯化，以得到纯度较高的α淀粉酶。
分离和纯化方法主要有凝胶过滤、柱层析、凝胶电泳等。
其中，柱层析常用于大规模生产，通过调节柱层析的条件（例如树脂种类、流速等），可以将α淀粉酶与其他杂质分离。
第五步：对纯化后的α淀粉酶进行特性研究分离和纯化后的α淀粉酶需要进行特性研究，了解其催化特性、抗温性和酸碱稳定性等。
这些特性研究有助于评估α淀粉酶在不同工业应用中的潜力和适用性。
除了以上步骤，还可以利用遗传工程手段对枯草杆菌的基因进行改造，提高α淀粉酶的产量和活性。
枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究
枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究摘要：淀粉是一种广泛存在于植物细胞中的高分子碳水化合物，具有丰富的能量和营养。
枯草芽孢杆菌是一种在自然界中广泛存在的产气厌氧菌，可以分解多种有机物质，包括淀粉。
本研究旨在通过淀粉酶的定向进化，提高枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
1. 引言随着人口的增长和生活水平的提高，对粮食的需求也在不断增加。
利用高效的淀粉水解酶进行玉米粉加工，可以提高淀粉的利用率和食品生产的效益。
2. 方法与材料2.1 枯草芽孢杆菌的培养与体外筛选首先，从自然环境中分离枯草芽孢杆菌，并通过连续传代培养。
然后，制备含有淀粉的琼脂培养基，通过扩展成分筛选培养出具有较高淀粉酶活性的菌株。
2.2 淀粉酶基因的筛选与克隆采用PCR技术，从高淀粉酶活性菌株中扩增出淀粉酶基因。
将扩增的目的基因与表达载体质粒进行连接，并转化到大肠杆菌中进行蓝白斑筛选。
2.3 淀粉酶的定向进化策略通过PCR技术，在淀粉酶基因的特定区域引入随机突变。
然后，选取淀粉酶活性较高的突变体，并继续进行下一轮突变和筛选工作，最终得到活性更高的定向进化淀粉酶。
2.4 玉米粉的水解实验将定向进化淀粉酶转化到枯草芽孢杆菌中，并对其进行培养。
然后，将玉米粉加入到培养基中，利用玉米粉的水解情况评估定向进化淀粉酶对玉米粉的水解能力。
3. 结果与讨论通过筛选和定向进化，我们获得了一株具有较高淀粉酶活性的定向进化淀粉酶。
将该基因转化到枯草芽孢杆菌中，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
4. 结论本研究通过淀粉酶的定向进化，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
这为进一步提高玉米粉的利用率和淀粉的加工效益提供了新思路。
5.通过连续传代培养和扩展成分筛选，我们成功获取了具有较高淀粉酶活性的菌株。
通过PCR技术，我们扩增出了淀粉酶基因，并成功将其连接到表达载体质粒上，并进行了蓝白斑筛选。
通过淀粉酶的定向进化策略，我们引入了随机突变，并筛选出了活性更高的突变体。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm 的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
枯草杆菌摇瓶发酵生产淀粉酶演示文稿
用途： 耐高温 α-淀粉酶具有极好的耐热性，能广泛 应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等 工业上。
产品特性 : (物理特性) 外观：棕褐色液体 溶解性：易溶于水 比重： 1.15-1.25g/ml
第27页，共42页。
中温a一淀粉酶活力： 1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，于60℃、pH=6.0条件下，
1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位， 以u/g(u/mL)表示。 耐高温a-淀粉酶活力：
1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，于70℃、pH =6.0条件 下，1 min液化 1 mg可溶性淀粉所需的酶量，即为1 个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。
60u/mL~65u/mL范围内。
第40页，共42页。
酶活力测定
吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于 70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀释好的 待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min；
钟液化可溶性淀粉的毫克数。
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α-淀粉酶制剂的理化要求
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α-淀粉酶制剂的卫生要求
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三、实验内容
微生物发酵法是酶制剂生产的主要方法。发酵生产中 多用液体深层发酵法制备酶。
大规模液体深层发酵之前，首先在实验室对保藏的目的菌 种进行活化和扩大培养，制得生产种子。
[化学物性] 钙离子对酶活稳定性的影响：较低浓度的钙离子存在，
本品即可有很好的稳定性，对于淀粉的水解，推荐 加入50-100ppm钙离子。 pH范围：5.5-7.0 最适6.0 温度范围： 90-95℃ 在喷射液化工艺中瞬间温度达 105-110℃，仍能有效
1 枯草芽孢杆菌的淀粉酶发酵1
一、目的要求
• 以具体的淀粉酶发酵生产工艺流程为例，使学 生掌握发酵原理，掌握种子制备、发酵过程控 制、与发酵相关参数的检测，掌握效价测定方 法，为学生提供理论联系实际的机会。
二、材料和用品
• 牛肉膏、蛋白胨、NaCL、淀粉 • 灭菌锅、培养箱、超净工作台、小型发 酵系统。
三、实验内容
（一） 、种子制备 1. 种子培养基配制 LB培养基：牛肉膏 ％，蛋白胨 ％， 培养基： ％，蛋白胨 ％，NaCL0.5％， 培养基 牛肉膏1％，蛋白胨0.5％， ％， pH7.0左右。 左右。 左右 2．培养基的分装及其灭菌 ． 将配好的培养基分装到250ml摇瓶中，每瓶100ml，最 将配好的培养基分装到 摇瓶中，每瓶 ， 摇瓶中 后将培养基置于121℃灭菌 后将培养基置于 ℃灭菌20min。 。 3．接种 ． 将已经活化的斜面种子接种到摇瓶中30℃摇床中培养。 将已经活化的斜面种子接种到摇瓶中 ℃摇床中培养。 4．培养时间及镜检 ． 一般种子培养需要2天左右 天左右， 一般种子培养需要 天左右，然后利用镜检来检测培养 过程是否染菌。 过程是否染菌。
（三）、 淀粉酶效价测定
1. 配制淀粉培养基 2％淀粉，2％琼脂 ％淀粉， ％ 2. 水解淀粉圈实验 用打孔器在平皿中央打孔， 用打孔器在平皿中央打孔，取0.1ml不同时间 不同时间 取样的发酵液于孔中，最后将平皿放置于30 取样的发酵液于孔中，最后将平皿放置于 ℃ 左右培养箱中培养并观察。 左右培养箱中培养并观察。
（二）、 发酵过程控制
1．发酵培养基配制（20L） ．发酵培养基配制（ ） LB培养基：牛肉膏 ％，蛋白胨 ％， 培养基： ％，蛋白胨 培养基 牛肉膏1％，蛋白胨0.5％， NaCl0.5％，泡敌 ％，泡敌 左右。 ％，泡敌0.03%，pH7.0左右。 ， 左右 2．培养基实罐灭菌 ． 将配好的培养基装到发酵罐中， 将配好的培养基装到发酵罐中，121℃灭菌 ℃ 20min。 。 3．接种 ． 将已经培养好的种子接种到发酵罐中， ℃ 将已经培养好的种子接种到发酵罐中，30℃培 养。 4．观察和取样 ． 观察发酵过程中是否存在异常情况， 观察发酵过程中是否存在异常情况，如发酵液 颜色、气味、溶氧等是否异常等情况。 颜色、气味、溶氧等是否异常等情况。每6h取 取 样一次，每次100ml左右，发酵时间 天。 左右， 样一次，每次 左右 发酵时间1.5天
产淀粉酶枯草芽孢杆菌
“生物制药技术实训”课程研究报告项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌一实验原理枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。
由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。
利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。
根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。
二材料灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。
三操作步骤1.包平板2.配生理盐水3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。
取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。
9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
产淀粉酶芽孢杆菌
产淀粉酶芽孢杆菌二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。
三、实验材料1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。
微生物学实验八 硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应
实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应（一）目的要求通过实验观察硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌的诱变效应。
初步掌握化学诱变育种的方法。
（二）基本原理许多化学因素如硫酸二乙酯、亚硝酸等，对微生物都有诱变作用。
硫酸二乙酯是一种烷化剂，能与DNA中碱基发生化学变化，从而引起DNA复制时碱基配对的转换或颠换。
一般化学诱变剂都有毒性，很多还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取，并防止与皮肤直接接触。
中止反应时，可以用大量稀释法或加入硫代硫酸钠。
本实验以产生蛋白酶的枯草芽孢杆菌为实验菌种，以硫酸二乙酯为诱变剂，根据枯草芽孢杆菌诱变后在培养基上出现的透明圈直径大小，来指示诱变效应。
（三）实验材料1. 菌种酶泥（菌悬液）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基＋0.5％可溶性淀粉（牛肉膏0.5%，蛋白胨1％，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%，pH7.0－7.2）。
3. 主要药品硫酸二乙酯(简写DES，(C2H5)2SO4)、25％硫代硫酸钠。
4. 器皿试管、移液管、锥形瓶、培养皿、离心管、玻璃涂棒、量筒、烧杯等。
（四）实验步骤1. 诱变前的准备工作1）菌种斜面的活化从冰箱取一支纯化后的枯草芽孢杆菌1.398斜面接种到新鲜肉膏蛋白胨斜面培养基上，置于30℃温箱培养24h进行活化。
2）枯草芽孢杆菌对数期培养液的制备取一环已活化的枯草芽孢杆菌接种到装有30 ml肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶内(每组同学2瓶)，在30℃振荡培养16h，此时为该菌的对数期。
3）准备平板将装在锥形瓶内已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷至45℃左右倾注10个平板待用。
4）菌悬液的制备取上述对数期的枯草芽孢杆菌培养液10 m1，3000 r/min 离心15 min ，沉淀下的菌体用10 ml 0.1mo/LpH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。
2. 硫酸二乙酯诱变处理 1）诱变吸取1 ml 菌悬液至盛有8ml 无菌水的试管内，再加硫酸二乙酯0.5 ml ，振荡处理5 min 。
淀粉酶实验方案
淀粉酶发酵制备一、实验目的1.学习并掌握从大曲中分离产淀粉酶菌种的方法1．学习并掌握液体摇瓶发酵法制备α-淀粉酶的工艺；2．掌握α-淀粉酶酶活测定原理及方法。
二、实验原理α-淀粉酶生产菌主要有芽孢杆菌和霉菌等。
芽孢杆菌所产α-淀粉酶由于活性高，发酵周期短，酶的耐热件高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。
α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶与α-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70℃保温 15 min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
另外，β-淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、实验器材与试剂1．实验器材（1）烧杯，三角瓶，玻璃棒，试管，容量瓶、离心管、移液管。
（2）电炉（加热板）、高压灭菌锅、恒温水浴锅、摇床、离心机、电子天平。
2．材料与试剂（1）菌种：大曲粉中产淀粉酶的菌种（经查资料为枯草杆菌）（2）培养基：1）斜面培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0-7.2。
2）种子液体培养基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0-7.2。
3）发酵培养基：葡萄糖 5%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水氯化钙0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH7.0-7.2。
（3）酶活测定：1）称取碘11 g，碘化钾22 g，加水溶解，稀释至500 mL。
2）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，定容至500 mL。
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枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验
化学与生命科学学院
摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。
通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。
关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。
通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
实验材料和方法
一、实验材料：
（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）
（二）培养基：
1、种子培养液
葡萄糖 1%
Tryptone(胰蛋白胨)：1%,
Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,
NaCl(氯化钠)：1%
调pH7.2
若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。
2、产淀粉酶发酵培养液
玉米粉 2 .0 %
黄豆饼粉1 .5%
CaCl 2 0 .02 %
MgSO4 0 .02%
NaCl 0 .25%
K2HPO4 0 .2%
柠檬酸钠0 .2%
硫酸铵0 .075%
Na2HPO4 0 .2 %
调节pH 值7 .0
（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）
（四）实验仪器
离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管
二、实验
1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。
2、种子斜面及种子液准备
– A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养
基，37℃，24h作菌种（3支/组）。
– B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于
250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。
– C. 在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培
养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。
（6瓶/组）
3、发酵培养
–按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵
培养基的250ml三角瓶中。
37℃培养48h。
–在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。
40-48h酶活降低后结束实验。
三、α淀粉酶活性测定
（1）上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。
（2）吸取0.1mL标准糊精溶液，转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中，以此作为比色的标准。
（3）在比色管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。
（4）定时（~15s）取出0.1mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反应终点，记录时间t
四、计算酶活
计算淀粉酶活力
酶活力(U/mL) =(60/t×20×2%×n)÷0.5
• 式中t为反应时间（分），
• n为酶液稀释倍数，
• 0.5是使用的酶液量（mL），
• 20是可溶性淀粉溶液体积ml
五、溶液配制
碘原液：
– 1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml，
贮于棕色瓶中；
0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
–称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.07g柠檬酸，用水
溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正其pH至6.0。
比色用标准碘液：
–取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中； 2%可溶淀粉：
–称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL
沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至透明（约
20min），冷却后加水定容至100ml。
（当天配制）。
标准糊精溶液
–称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷
却后加水定容到100ml
结果
α-淀粉酶产生的时间
在上述培养条件下，12小时之前蛋白酶活力较低，36小时达到高峰，继续培养至60小
时，酶活逐渐下降，结果见表1。
表α-淀粉酶活力与培养时间的关系 .
α-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强，进入对数期后，酶活显著提高。
培养至36小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达
到高峰。
参考文献
1.唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53 62-5363,5371
2. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化型α-淀
粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化[J]. 食品与生物技术学报, 1984, (02)。