显微镜技术发展

QiDong 2007,10
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微分干涉称/DIC
检偏镜Analyzer
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DIC 滑板
物镜
万能聚光镜， DIC棱镜
起偏镜 Polorizer
卤素灯
DIC－PH
Robert Hoffman ，1975
斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不 同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。
反卷积（Deconvolution）显微镜
优点 (v. confocal) 低光漂白 高的S/N 低价格
Disadvantages 速度慢，结果实验经验影响
反卷积（Deconvolution）显微镜
•优势
•低的光漂白 •高图像获取速度 •信噪比较高 •可以进一步改善共聚焦显微镜获取的图像 •可以获得更弱信号的高信噪比图像 •价格较低
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1886苛勒, 改进显微镜照明方式，充分发挥Abbe物 镜的优势 19世纪末分别出现了金相显微镜、消象散物镜、双目 显微镜和体视显微镜
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放大高、分辨率高就清晰吗？
• 二十世纪显微镜的主要进展是反差技术的提高
• 暗场 • 偏光 • 相差 • DIC • 浮雕相称 • 荧光 • 共聚焦 • 双光子 • TIRF
图片来自于Dr. Steve Ruzin
1955年MINSKY发明共聚焦原理
1951年，Minsky建构了世界上第一个神经 元网络模拟器
是MIT AI 实验室的创办人之一
被认为是20世纪人工智能研究的奠基人之 一
共聚焦原理
共聚焦针孔 (Pinhole)
分光镜
光电倍增管 (PMT) 荧光滤光片 (发射光滤色片)
1932年Edwin H. Land宣布发明偏 振片
偏光显微镜
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矿物质、化学物品鉴别
鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体
植物病理检验
鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌、毛发、肝脏胶原
和伤口愈合等
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相差显微镜
Frits Zernike (1888-1966), 1934年发现相差原理，1938 年生产出第一台相差显微 镜，1953 获诺贝尔奖
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有放大就清晰吗？
象差和分辨率概念
1666年牛顿发现棱镜光谱分离现象 1729年Chester Moore Hall 在大型透镜 上使用了消色差技术 19世纪上半叶Lister生产出消色差NA 0.65的干镜 1873年Ernst Abbe发现显微镜透镜的光 学原理: R∝k*λ/NA 1876年Ernst Abbe发现各种颜色的校对 开始指导研发复消色差物镜 1886年Schott and Associates, Inc. 生 产出第一个复消色差物镜
古代显微镜历史上的两个重要人物
Robert Hooke (1635-1703) 使用复式显微镜 第一个提出细胞概念 绘制了许多精美的显微图像
古代显微镜历史上的两个重要人物
Leeuwenhoek 设计了几百种功能较简单的显微镜， 放大倍率取决于透镜质量可以从70X到250X ， 分辨率可以达到约1um， 绘制出原生动物、细菌和红细胞等
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Image from parker lab, Dept. Neurobiology & Behavior, University of California, Irvine
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x y
Z+2 Z+1 Z0 Z-1
Z-2
通过将光程差转变成振幅差的办法，使原本不可见的透明的活细胞或组 织标本得以以明暗反差的方式展示出来，无需对标本进行杀死和染色。
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相差显微镜
优点： 鉴定活细胞最实用、最经济的方法
非常适合薄的活细胞标本观察
缺点： 稍厚标本或悬浮细胞会反差过大
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微分干涉称/DIC
•劣势
•处理速度慢 •需要较高专业知识和实际经验 •对球场比较敏感
2-photon
• 1931Mayer博士预言多光子 现象。
• 30年后被实验证实 • 1963年获得诺贝尔奖
2 Photon
2 Photon Microscope
•优势： •长波长激发激发深度更大 •焦平面外几乎激发无荧光 •低的标本刺激 •无需针孔阻挡，采集效率高
显微技术的发展
奥林巴斯（北京）销售服务有限公司
齐冬
2007，10 武汉
人眼观察事物的大小
透镜的历史
公元前2500年埃及玻璃制品 公元前1世纪有吹制玻璃 公元1世纪：凸透镜——放大镜，燃烧玻璃 13世纪透镜被称为Lens（象扁豆“lentil”的种子) 15世纪在威尼斯发现水晶，叫cristallo 1675年在玻璃中加入铅氧化物改进折射率和色散 1902年Irving W Colburn申请玻璃拉制仪，大规模生产玻璃门窗 1904 Michael Owen 申请玻璃容器专利
激光
物镜 标本
激光在标本平面做点－点扫描
共聚焦显微镜的共轭平面 5
激光扫描共聚焦显微镜的监测器
Photomultiplier Tube (PMT)
• 点采集 (不象CCD一样直接记录图像) • 高敏感度(适合暗光采集) • 大采集靶面 • 低噪音 • 反应快速
AOTF
局部刺激和扫描——ROI 0.1%激光强度调整，快速----普百度文库ND只能1％调节，且速度慢 减少荧光粹灭
细胞样品来自北京中医医院
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取图激光 488nm＆543nm
同步激光 405nm
任意时间, 任意位置
Data from; Dr. Atsushi Miyawaki and Ms. Ryoko Ando in RIKEN BSI
Laser Sscanning Confocal Microscope
• 活细胞相关研究
• SIM • 活细胞成像系统
暗场显微镜
丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反 射或衍射，增大了人眼可见性。
实际所见为光放大的光斑，极高 的放大率 极黑暗的背景 适合石油、微生物、神经生物等 研究
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偏光显微镜
依据波动光学原理观察和精 密测定标本细节,或透明物 体改变光束的物理参数,以 此判别物质结构的一种显微 镜
囊泡 膜
胞吐
消逝波
神经递质
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•优点
•厚标本更清晰的单层结构/光切 •同步多通道荧光 •ZOOM •光操作
•缺点
•更大的光损伤 •慢的扫描速度 •昂贵的价格 •扫描深度仍然有限
NIPKOW
转盘式共聚焦和激光扫描共聚焦
1884年，德国工程师尼普科夫(Paul Nipkow)利用硒光 电池发明了一种机械扫描装置，这种装置在后来的早 期电视系统中得到了应用，
与AOTF功能结合 ——荧光漂白后恢复（FRAP)
AOTF/ZOOM
光刺激和取图分别间隔进行
488nm获取图像
选取AOTF/ZOOM位置
405nm激光刺激， 获取AOTF/ZOOM图像
双扫描光诱导——快速、同步光诱导
如何完成双扫描?
引入了一个独立的扫描单元 “SIMS”
同步激光 扫描
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细胞质内多点快速FRAP
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荧光显微镜的优点和用途
优点：
• 检出能力高（放大作用） • 对细胞的刺激小（可以活体染色） • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察——荧光素 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体
荧光等 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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宽场照明显微镜和共聚焦图像比较
1952年Georges Nomarski 发明并注册DIC
专利
通过特制的棱镜将偏振光分解为振动方向相互垂直，强度相等的光 束，光束在极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从 而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。
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微分干涉称/DIC
比相差分辨率更高、有明显的三维立体感 更适合厚标本观察 双折射物质不能达到DIC镜检效果 不能应用于塑料容器培养物的观察
低折射率 高折射率 q
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
TIRF系统物镜:
APO100XOHR (NA1.65) PLAPO100XOTIRFM (NA1.45) PLAPON60XOTIRFM (NA1.45) UAPO150XOTIRFM (NA1.45) APON60XOTIRFM (NA1.49)
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提高未染色标本的可见性和对比度； 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕； 可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ； 可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织； 聚光镜的工作距离可以设计的更长；
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荧光显微镜的原理在1904年就由Köhler发现，而直到1970年才被广泛 应用。 镀膜技术、无限远技术的运用，使荧光显微镜的应用产生了质的飞跃。 And fluorescence microscopy, in principle already seen by Köhler in 1904, has become a very valuable addition to light microscopy since about 1970.
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第一台复式显微镜
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Zacharias Janssen and Hans Janssen
此前眼镜已经被使用 Janssen‘s 显微镜包括双面凸透镜的目镜和单面凸的物镜,通过伸缩 镜筒可以进行10X－3X的观察 通常用来看跳蚤或小的爬行动物因此又叫“跳蚤镜”（flea glasses)
S. Simon et. al/Rockefeller Univ.
TIRFM 应用
• Cell 表面成像
– 细胞/底物接触
– 膜表面动力学/蛋白质定位研究
• 单分子成像
– 肌球蛋白，肌动蛋白与Cy3标记ATP
• 胞吐/胞吞作用(配合高速CCD) • 心肌Ca2+火花(配合高速CCD)
细胞膜研究 Ex.
•劣势： •价格高 •分辨率不如共聚焦 •对管理者要求比较高
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TIRFM 原理
TIRFM
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波有效传播范围只有盖玻片后百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm