细胞工程-动物细胞培养
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细胞工程-动物细胞培养
细胞计数
四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左 线和上线边的细胞。 细胞密度个/ml＝平均细胞数x10^3x稀释倍数
细胞工程-动物细胞培养
培养细胞活力测定
细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。
1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细
胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细 胞的增殖能力
克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
细胞工程-动物细胞培养
2. 台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色， 用活细胞占细胞中的百分比表示细 胞活力
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规 工作。细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减少污染， 减少细胞生物学特性变化。
细胞工程-动物细胞培养
细胞工程-动物细胞培养
液氮罐
细胞工程-动物细胞培养
Cryopreservation
How does freezing induce damage?
cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration
2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。
3） 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 养液，继续培养。
细胞工程-动物细胞培养
（3）建系过程
组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向 外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可 以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长 开始明显加快，并向周围延伸。 用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维 细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁 生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周 后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长， 命名为ECA109。 ECA109 经生物学特性分析 后确定细胞系建立成功
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温 度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器
transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth
Thawing rate is also important (thaw rapidly)
最适度以下的
最适度以上的
细胞工程-动物细胞培养
动物细胞培养技术－2
细胞工程-动物细胞培养
（一）常用的培养方法
悬滴培养Hanging－drop cultivation 培养瓶培养 旋转管培养Rotate tube cultivation 克隆培养法Cloning culture technique 细胞同步化培养 动物细胞大规模培养
细胞工程-动物细胞培养
（2）加入2mg／ml的MTT液（50ul／孔）； 继续培养3小时。
（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液 （150ul／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上 振荡10分钟，使结晶物溶解。
（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长 570nm），记录结果，绘制生长曲线。
细胞工程-动物细胞培养
（四）细胞冻存和复苏
细胞工程-动物细胞培养
建立细胞系的要求
国际上对Certified cell的确定尚无统一 标准 1 组织来源 2 细胞生物学检测：形态，特异结构， 细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特 异性如腺细胞，肿瘤细胞 3 培养条件和方法
细胞工程-动物细胞培养
（三）细胞系和细胞株鉴定
鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性， 污染情况 鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长 曲线，计算分裂指数，染色体组型和带 型分析，同工酶酶谱检测 档案资料及管理使用：美国标准细胞库 ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰 老细胞库CAR
(1) 吸出培养瓶内旧培养液。 (2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 (3) 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细
胞质回缩现象，终止消化。 (4) 吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以
免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 (5) 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。
细胞工程-动物细胞培养
（二）建立细胞系过程
细胞工程-动物细胞培养
肿瘤细胞的体外培养与建系过程
以人上皮型食管癌109细胞系的建立为 例介绍一下具体的建系过程：
细胞工程-动物细胞培养
（1）取材
食百度文库癌患者的手术标本
细胞工程-动物细胞培养
（2）原代培养
1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小 时。
（1）原代培养与传代培养
细胞工程-动物细胞培养
1 取材
取材部位是否准确 组织是否保持活性 材料处理是否恰当
Trypsin－EDTA collagenase
细胞工程-动物细胞培养
2 原代培养——组织块培养
组织块的培养
细胞工程-动物细胞培养
3 传代培养——消化法
细胞工程-动物细胞培养
一般传代培养的步骤
MTT法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。
细胞工程-动物细胞培养
操作步骤:
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103104 细胞/孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养 板每孔容积370ul），37℃、5％CO2培养箱中培 养一段时间（根据实验目的决定培养时间）
细胞工程-动物细胞培养
3 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干
水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞 中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜 （DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 再用酶标仪测定OD值
细胞计数
四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左 线和上线边的细胞。 细胞密度个/ml＝平均细胞数x10^3x稀释倍数
细胞工程-动物细胞培养
培养细胞活力测定
细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。
1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细
胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细 胞的增殖能力
克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
细胞工程-动物细胞培养
2. 台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色， 用活细胞占细胞中的百分比表示细 胞活力
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规 工作。细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减少污染， 减少细胞生物学特性变化。
细胞工程-动物细胞培养
细胞工程-动物细胞培养
液氮罐
细胞工程-动物细胞培养
Cryopreservation
How does freezing induce damage?
cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration
2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。
3） 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 养液，继续培养。
细胞工程-动物细胞培养
（3）建系过程
组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向 外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可 以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长 开始明显加快，并向周围延伸。 用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维 细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁 生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周 后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长， 命名为ECA109。 ECA109 经生物学特性分析 后确定细胞系建立成功
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温 度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器
transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth
Thawing rate is also important (thaw rapidly)
最适度以下的
最适度以上的
细胞工程-动物细胞培养
动物细胞培养技术－2
细胞工程-动物细胞培养
（一）常用的培养方法
悬滴培养Hanging－drop cultivation 培养瓶培养 旋转管培养Rotate tube cultivation 克隆培养法Cloning culture technique 细胞同步化培养 动物细胞大规模培养
细胞工程-动物细胞培养
（2）加入2mg／ml的MTT液（50ul／孔）； 继续培养3小时。
（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液 （150ul／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上 振荡10分钟，使结晶物溶解。
（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长 570nm），记录结果，绘制生长曲线。
细胞工程-动物细胞培养
（四）细胞冻存和复苏
细胞工程-动物细胞培养
建立细胞系的要求
国际上对Certified cell的确定尚无统一 标准 1 组织来源 2 细胞生物学检测：形态，特异结构， 细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特 异性如腺细胞，肿瘤细胞 3 培养条件和方法
细胞工程-动物细胞培养
（三）细胞系和细胞株鉴定
鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性， 污染情况 鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长 曲线，计算分裂指数，染色体组型和带 型分析，同工酶酶谱检测 档案资料及管理使用：美国标准细胞库 ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰 老细胞库CAR
(1) 吸出培养瓶内旧培养液。 (2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 (3) 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细
胞质回缩现象，终止消化。 (4) 吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以
免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 (5) 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。
细胞工程-动物细胞培养
（二）建立细胞系过程
细胞工程-动物细胞培养
肿瘤细胞的体外培养与建系过程
以人上皮型食管癌109细胞系的建立为 例介绍一下具体的建系过程：
细胞工程-动物细胞培养
（1）取材
食百度文库癌患者的手术标本
细胞工程-动物细胞培养
（2）原代培养
1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小 时。
（1）原代培养与传代培养
细胞工程-动物细胞培养
1 取材
取材部位是否准确 组织是否保持活性 材料处理是否恰当
Trypsin－EDTA collagenase
细胞工程-动物细胞培养
2 原代培养——组织块培养
组织块的培养
细胞工程-动物细胞培养
3 传代培养——消化法
细胞工程-动物细胞培养
一般传代培养的步骤
MTT法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。
细胞工程-动物细胞培养
操作步骤:
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103104 细胞/孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养 板每孔容积370ul），37℃、5％CO2培养箱中培 养一段时间（根据实验目的决定培养时间）
细胞工程-动物细胞培养
3 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干
水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞 中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜 （DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 再用酶标仪测定OD值