三种鹿科动物线粒体全基因组序列的测定及分析

动物 mtDNA 为共价闭合的双链分子，大小为 16.5 kb 左右，基因排列极为紧凑，除 D-loop 区有非编码区外，其余都为基因编码区，这些基因编码区编码 37 个基因：2 个 rRNA 基因、 13 个蛋白质编码基因和 22 个 tRNA 基因。mtDNA 呈现母系单性遗传，世代传递中不发生 重组；进化速度快，用作遗传分析灵敏度高；无组织特异性，细胞中含量丰富。基于上述特 点，利用 mtDNA 序列提供的信息已广泛应用于各种动物物种的鉴定上。
1. 3 主要实验设备及来源 Eppendorf AG：基因有限公司 PCR System 9700：基因有限公司 电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司 凝胶成像系统：基因有限公司 电子天平：上海恒平科学仪器有限公司 普通离心机：Sigma 公司 恒温水浴锅：浙江省余姚市检测仪表厂
1.4 引物设计及最佳退火温度的设定 利 用 GenBank 数 据 库 中 已 公 布 的 鹿 科 动 物 线 粒 体 全 基 因 组 序 列 （ NC_008749 、
Sequencing and Analysis of Complete Mitochondrial Genominc
DNA Sequences about Three Animals of Cervidae
ZHA Dai-Ming1, 2 YANG Fu-He1 ZHANG Zhao-gang3 XING Xiu-Mei1**
Table 2 Composition and condition of PCR reaction
反应体系（μl） 反应体积（微升） 9.9 1.5 2.0 0.2 0.2 0.2 1.0
反应温度（°C） 94 94 50-60 72 72
反应条件
反应时间
5 分钟 30 秒
30 cycles
30 秒
从 GenBank 数据库中获得部分鹿科动物线粒体全基因组序列：梅花鹿（NC-008462、 NC-007179、NC-006993、NC-006973）、赤鹿（NC-007704）、水鹿（NC-008414）、驯鹿 （NC-007703），联合本文中的东北梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿线粒体全基因组序列， 用 Clustal X 1.83 软件对它们进行序列比对后，以驯鹿为外群，采用 MEGA 4.0 中的 NJ 法和 MP 法构建系统进化树，bootstrap 分析包含 1000 次重复。
应用 MEGA 4.0 统计序列总长、碱基百分比、GC 含量等信息，并与台湾梅花鹿线粒体 全基因组序列进行比较。通过与台湾梅花鹿线粒体全基因组序列比较和软件分析（Clustal X 1.83、tRNA Scan-SE 在线软件）定位 tRNA 基因、蛋白编码基因、rRNA 基因和 D-loop 区。
摘要：利用 GenBank 数据库中鹿科动物线粒体全基因组序列，设计了可覆盖鹿科动物线粒体 基因组序列的引物，利用这些引物对东北梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿的线粒体进行了全 基因组测序，并将注释完全的序列提交到 GenBank 数据库，同时对这些序列进行了分析，最 后联合 GenBank 数据库中的鹿科动物线粒体全基因组序列，Clustal X 1.83 软件序列比对 后，利用 MEGA 4.0 软件对梅花鹿、马鹿和赤鹿进行了系统进化分析。结果表明：梅花鹿存 在 3 个明显的支系，即中国种群（大陆和台湾）、日本南部种群和日本北部种群，且大陆梅 花鹿与日本南部梅花鹿的亲缘关系更近，日本梅花鹿分化为南、北两个种群，至少通过两个 大陆桥在晚更新世从亚洲大陆迁徙至日本，台湾梅花鹿可能已达到了种的水平；Cervus elaphus 起源于中亚，向东、西两个方向分化，形成了两个不同的物种即马鹿（亚洲-北美 种群）和赤鹿（欧洲种群），马鹿与梅花鹿的亲缘关系更近，塔里木马鹿是赤鹿的祖先；梅 花鹿和马鹿有最近的共同祖先，与赤鹿的祖先在中亚地区分别向东、西两个方向迁徙进化， 最终向东分化为梅花鹿和马鹿，向西分化为赤鹿。 关键词：鹿科动物；线粒体；全基因组；
(1. Institute of Special Economic Animal and Plant Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jilin 132109; 2 School of Biotechnology and Environmental Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018;3. NingAn Farm deer industry at HeiLongJiang NingAn 157400)
到目前为止，GeneBank 数据库中已登录了 9 种鹿科动物线粒体全基因组序列，它们分 别是鹿亚科的梅花鹿（3 个日本亚种和 1 个台湾亚种）、赤鹿和台湾水鹿，麂亚科的毛冠鹿、
赤麂、黑麂和小麂，獐亚科的獐，美洲鹿亚科的驯鹿。为了更好地利用 mtDNA 序列来鉴定 各种鹿产品以及对中国茸鹿开展系统进化方面的工作，因此本文在利用这 9 种鹿科动物线粒 体全基因组序列的基础上，设计了可覆盖鹿科动物线粒体全基因组序列的引物，利用这些引 物对东北梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿的线粒体进行了全基因组测序，并且对这 3 种鹿的 线粒体全基因组序列进行了分析。
物在 1%琼脂糖凝胶中进行电泳பைடு நூலகம்确定其大致浓度。
1.5.2 纯化产物的测序及序列拼接 纯化后的 PCR 产物由上海生工生物有限公司进行双向测序，测序反应采用双脱氧链终
止法，测序所用的引物均为 PCR 扩增时所用的引物。利用 Bioedit 7.0.9.0 软件对测序结果进 行序列拼接，最后得到东北梅花鹿（C. n. hortulorum, CNH）、东北马鹿（C. e. xanthopygus, CEX ）和塔里木马鹿（C. e. yarkandensis, CEY）全基因组序列，利用 GenBank 中的在线软 件 BLASTn 将得到的序列与 GeneBank 数据库中的序列进行比对以检验所得序列是否正确， 确认正确后提交到 GeneBank 数据库获得登录号，分别为 GU457433、GU457434、GU457435。 1.5.3 序列分析
1 材料与方法
1.1. 实验样品 左家梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿基因组 DNA 各一份。
1.2 主要试剂及来源 Taq 酶：TaKaRa 生物工程（大连）有限公司 dNTPs（dATP, dTTP, dGTP, dCTP）：TaKaRa 生物工程（大连）有限公司 引物：上海生工生物有限公司合成 琼脂糖：GENE TECH（SHANGHAI） 琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒：北京百泰克生物技术有限公司
最佳退火温度 (°C) 59 55 54 56 54 54 57 58 54 54 54 58 58 58
*台湾梅花鹿线粒体全基因组序列（NC-008462）中的位置。
反应试剂 ddH2O 10 × Buffer dNTPs 引物 1 引物 2 Taq 酶 DNA 模板
表 2 PCR 反应体系及反应条件
NC_004563、NC_004069、NC_008491、NC_007703、NC_008414、NC_007704、NC_008462、 NC_007179、NC_006993、NC_006973）采用 Bioedit 7.0.9.0 软件进行序列比对，在保守区 用 Oligo 6.0 根据台湾梅花鹿（C. n. taiouanus, CNT）线粒体全基因组序列设计可覆盖鹿科动 物线粒体全基因组序列的引物（表 1），扩增片段之间相互重叠 100 bp 左右。
反应温度（°C） 94 94 根据表 3.1 72 72
反应条件
5 min 30 s 30 s 1 min 10 s 5 min
反应时间 30 cycles
反应结束后取 5 微升 PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记
录实验结果。根据 DNA 纯化试剂盒中的说明书对 PCR 产物进行纯化，纯化后取 3 微升产
为了使所有引物获得最佳 PCR 扩增结果，对每对引物进行梯度 PCR，退火温度的梯度 范围为 50～60 °C，每隔 2 °C 设一个梯度。PCR 试剂的工作浓度：Taq 酶 5 单位/微升， 10×PCR buffer 包含 500 豪摩 KCl 和 15 豪摩氯化镁，dNTPs 100 微摩，引物 50 微摩。反 应在 Eppendorf AG 上进行，反应体系及反应条件见表 2。
三种鹿科动物线粒体全基因组序列的测定及分析
查代明 1, 2 杨福合 1 张兆刚 3 邢秀梅 1**
（1. 中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学省部共建实验室 特种经济
动物种质资源遗传改良重点开放实验室 吉林 132109；2. 江苏科技大学生物与环境工程学院
镇江 212018；3.黑龙江省宁安农场鹿业公司 黑龙江 157400)
表 1 覆盖鹿科动物线粒体全基因组的引物
名称
D01 D02 D03 D04 D05 D06 D07 D08 D09 D10 D11 D12 D13 D14
Table 1 Primers for amplifying the complete mitochondrial genome of Cervidae
反应结束后取 5 微升 PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记 录实验结果，根据凝胶中条带的亮度确定每对引物的最佳退火温度（表 1）。 1.5 线粒体全基因组序列的测定及分析 1.5.1 PCR 扩增及产物的纯化
PCR 试剂的工作浓度：Taq 酶 5 单位/微升，10×PCR buffer 包含 500 豪摩 KCl 和 15 豪 摩氯化镁，dNTPs 100 微摩，引物 50 微摩。反应在 PCR System 9700 上进行，反应体系及 反应条件见表 3。
位置*
上游引物 下游引物