查尔酮异构酶分子生物学研究进展

3.2 催化反应发生过程及分子机理
CHI 催化的分子内环化反应需要底物具有 2’位羟基，反应开始于对底物查尔酮 2’-羟基 的去质子化，产生的 2’-氧负离子对 α,β-不饱和双键的 β-碳原子进行亲核攻击，产生 2'-酸性 在 pH7.5 时， CHI 催化 4,2’,4’,6’羟基基团 （图 3） 。 CHI 催化的这种环化反应是 pH 依赖的[19]， 四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮、 2’,4’-二羟基查尔酮的催化活性达到 90%以上， 而 4,2’二羟基查尔酮很低的环化效率也反映出它的 2’位羟基基团的高 pKa 值。在 pH6.0 时，CHI 催化 4,2’,4’,6’-四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮的催化活性只有 50%， 而 CHI 催化 2’,4’二羟基查尔酮和 4,2’-二羟基查尔酮的催化活性更低。比较 CHI 与 7,4’-二羟基黄烷酮、7-羟 基黄烷酮和 4’-羟基黄烷酮复合物的晶体结构，显示所有的 7-羟基黄烷酮都有共同的结合方 式，而 4’-羟基黄烷酮则结合在活性部位的另一侧[19]。
4. CHI对黄酮代谢的调控
研究表明 CHI 是黄酮代谢途径中一个很重要的关键酶， 降低 CHI 酶活性或 CHI 突变体 能导致植物中查尔酮大量积累，黄酮化合物的含量显著降低。如：降低翠菊（C.chinensis）
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、康乃馨（Dianthus caryophyllus）[24]、仙客来（Cyclamen persicum）[25]的 CHI 酶活性，
图 2 CHI 催化反应示意图 Overall reaction 化生成(2RS)-黄烷酮， 但只有(2S)-黄烷酮是后来的黄酮 类化合物代谢过程的中间产物，而由 CHI 催化的反应速度是自发反应速度的 107 倍，且催化 产物中 99.999%的是(2S)-黄烷酮[16]。植物中缺少 CHI 活性的突变体，如拟南芥 tt5 突变体仅 能产生很少量的类黄酮，影响种子的正常着色[17]。而若将 typeⅠ的 chi 基因转到拟南芥 tt5 突变株中使其过量表达，可以使转化株产生正常的柚皮素而使种皮颜色恢复正常[18]。

查尔酮异构酶分子生物学研究进展
李琳玲 1，2，许锋 3，程华 3，程水源 1*
1 黄冈师范学院生命科学与工程学院，湖北黄州（438000） 2 河北农业大学园艺学院，河北保定（071001） 3 长江大学园艺园林学院，湖北荆州（434025）
E-mail：s_y_cheng@
黄酮类化合物是一类多酚类次生代谢物质，具有很多重要功能，如紫外防护、抗病原微 生物、参与花色形成、植物的育性、及植物与微生物相互识别协作等等。而且，它们对人类 的健康也越来越有着密切的作用，很多研究已证实其具有抗氧化、清除自由基、保护心脑血 管、抗癌抗肿瘤和抗炎症等多种功能。CHI（chalcone isomerase；EC 5.5.1.6）是黄酮类代谢 途径中的一个关键酶，催化分子内环化反应，使双环的查尔酮转化为有生物学活性的三环 （2S）-黄烷酮。很多研究表明，查尔酮异构酶是黄酮类化合物代谢途径的一个关键酶，因 此， 近年来该酶也成为黄酮代谢调控工程研究的一个热点酶。 本文对目前国内外查尔酮异构 酶分子生物学及其在黄酮代谢调控方面的研究进展进行了综述。
图 1 CHI 蛋白质的三维空间结构模型[14] β-strands 用蓝色片段表示；α-helices 用黄色螺旋表示；翻转和环绕用线条表示
CHI 蛋白质这种特殊的三维折叠形式在植物中是独特的，也被看成植物特有的基因标 记
[14]
。虽然鬼箭羽（E.ramulus）中的 CHI 蛋白质具有对柚皮素、紫铆因、异甘草素异构化
成为相应查尔酮的活性，但植物中的 CHI 蛋白末梢的 α-螺旋区域包含几个可以使植物 CHI 发生二聚作用的氨基酸残基， 在细菌等地等生物中不含有这些氨基酸残基， 因此低等生物中 虽然有 CHI-like 的蛋白，但不会形成相似的二聚物[8]。
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3. CHI催化反应机理
3.1 在植物黄酮、异黄酮代谢途径中的作用
现代分子生物学研究已经证实了类黄酮代谢是由内质网上由诸如查尔酮合成酶、 查尔酮 异构酶和黄烷酮醇-4-还原酶等组成的酶复合体进行催化反应的模型[15]。在这个酶复合体中， CHI 的表达可受光、植物病原感染、真菌感染和损伤的诱导[1, 5]，催化由上游酶 CHS 催化生 成的查尔酮（4,2’,4’,6’-四羟基查尔酮）和 6’-脱氧查尔酮（4,2’,4’-三羟基查尔酮）分别生成 相应的(2S)-柚皮素 （5,7,4’-三羟基黄烷酮） 和(2S)-5-脱氧黄烷酮 （7,4’-二羟基黄烷酮） （图 2） 。 (2S)-柚皮素和(2S)-5-脱氧黄烷酮经过进一步的糖基化、 异构化等反应分别生成黄烷酮、 黄酮、 黄酮醇、花色素，异黄烷酮、异黄酮、异黄酮醇等。
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子3更明显[11]。分析全世界24种生态型的拟南芥的编码查尔酮异构酶基因（长度约1.9kb）却 未发现明显的证据证明CHI区域的二态性[12]。 目前对查尔酮异构酶的调控序列了解较少。Van Tunen等在矮牵牛中分离出了chiA和 chiB基因的启动子序列，并分析了它们的时空表达模式。其中，chiA的启动子区域是两个独 立的启动子（PA1、PA2）串联结构，且两个启动子都具有独自的功能。下游的PA1启动子在 花冠组织中驱动chiA基因表达，而上游的PA2启动子仅在花药发育后期和花粉粒组织中启动 chiA基因表达。chiB基因只有一个启动子PB，且仅仅在花药发育早期（包括花粉和毯毡层细 胞）驱动chiB基因特异地表达。chiA和chiB基因的启动子区域有37bp的高度保守的DNA序列
、橙（Citrus safivum L. var Alaska）[5]、紫花苜蓿（M. sativa）[6]、翠菊（Callistephus chinensis） sinensis） 、水母雪莲（Saussurea medusa）[7]等多种植物中克隆出来。这些克隆出的查尔酮异 构酶基因， 按其作用底物的不同可以分为两种类型。 一类是存在于非豆科植物的仅能催化6’羟基查尔酮转化为5-羟基黄烷酮（TypeⅠ） ；另一类存在于豆科植物的能催化6’-羟基查尔酮 和6’-脱氧查尔酮转化为相应的5-羟基黄烷酮和5-脱氧黄烷酮（TypeⅡ） 。目前研究表明，除 在植物中普遍存在查尔酮异构酶基因外，在真菌、粘土霉菌和很多γ蛋白细菌中，都存在与 植物CHI直系同源（orthologous）的类CHI蛋白基因，但都缺乏CHI的上游酶CHS[8]。根据 Michael Gensheimer等人[8]的工作，可以把真菌和细菌中的类CHI蛋白基因家族归为TypeⅢ。 CHI基因在结构上变化较大，有报道表明，CHI cDNA序列的同源性一般在42~65%间[9]， 不同类型的chi基因间即使在同一物种间差异也比较大。在豆科植物Lotus japonicus中，同属 TypeⅡ的CHI1、 CHI3基因都4个外显子组成， 而且各个外显子均是高度保守的， 而属于TypeⅠ 的CHI2基因的方向相反并且仅含有3个外显子，外显子1接近同源TypeⅡCHI基因的外显子1 和2的总长，外显子2和3却分别与同源TypeⅡCHI基因的外显子3和4长度相似[10]。因此，认 为TypeⅡCHI基因的外显子1和2 是由typeⅠCHI的外显子1在复制中插入了一个内含子[10]。 在不同栽培品种的大豆的查尔酮异构酶的5'非翻译区（UTR）差异表现为单核苷酸的差异 （SNPs） ，而内含子3则表现出单核苷酸差异（SNPs）和插入-缺失，且5'- UTR的变异比内含
1. 查尔酮异构酶基因结构及表达调控
自1987年chi基因首先从法国豌豆中利用抗体技术分离出来以来[1]，chi基因已陆续从矮
[2] [3] [4] 、 菜豆 （Phaseolus vulgaris） 、 玉米 （Zea mays L.） 、 豌豆 （Pisum 牵牛 （Petunia hybrida）
图 4 结合柚皮素的 CHI 酶活性位点氢键 View of the active site hydrogen bond network in the CHI·naringenin complex
CHI 酶活性位点的结构限制了作用底物查尔酮异构酶的结构， 一条侧链突入催化腔内从 而防止形成 2R-黄烷酮[14]。热力学微扰法研究发现，在水中 CHI 的作用底物查尔酮有两个 构象（Ⅰ和Ⅱ） ，只有构象Ⅰ能在靠近时产生亲核 O2’和亲电子 C9 的构象；在 CHI 上，构 象Ⅰ的结合比构象Ⅱ的结合要松， 这为基态的 CHI 由激发态到过渡态转化起到重要作用[21]。 因此可以说 CHI 催化的分子内环化反应实际上是一个最初是受熵和诱导契合驱动的近乎扩 散控制的环化反应，而酶结构正是造成此空间特异性反应的原因[14]。CHI 催化反应产物柚 皮素对酶活性位点的特异性结合可以提供完全的动态保护来阻止苯甲酸汞或 HgCl2 等汞制 剂对酶的灭活[22]。
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。
2. 查尔酮异构酶的蛋白质结构
CHI的蛋白质分子量大约24~29kDa，不同物种间，多肽链表现出高度的同源性，不同植 物间蛋白质的同源性在49%~82%间[14]，同一类型的CHI酶蛋白质同源性可达70%以上，但不 同类型间仅有50%左右同源性[10]。 CHI 的整体空间结构就像是由开面的 β- 三明治折叠形成的倒置的花束（ The overall structure of CHI resemblesan upside-down bouquet that adopts an open-faced -sandwich fold） 。 一 个大的 β 折叠 （β-sheet） （β3a-β3f） 和由 3 个短的 β 折叠链 （β aβ bβ） 连结的一层 α-螺旋 （α1-α7） 。 在大的 β 折叠的反面形成一个核心结构[14]（图 1）
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图 3 CHI 催化的分子内环化反应过程 The reaction processes of the intramolecular cyclization catalyzed by CHI