布病检验技术及研
布鲁氏菌病诊断的特异性实验室检查技术
布鲁氏菌病诊断的特异性实验室检查技术从可疑布病患者分离布鲁氏菌A1.1血培养A1.1.1 双相培养基培养 :无菌从可疑病人静脉取血液4-5mL,在酒精灯火焰附近将血液注入5-6支含双相培养基的中试管内，或 2-4 只含双相培基烧瓶中，轻轻混合倾斜，使被检血液分布在琼脂斜面上，置37℃温箱培养，如果怀疑病人是牛种布鲁氏菌感染时，应有一半标本置C02环境中培养，三天后观察结果，如未见布氏菌生长，可按上法再倾斜，使血液涂在琼脂斜面上，继续培养，每隔一天观察一次，如有可疑布鲁氏菌落，可用铅金耳勾出接种到琼脂试管培基，获得纯培养，进一步作布氏菌鉴定，血培养三十天仍不出菌，可定为阴性。
A1.1.2 接种未受精鸡卵法 :取新鲜鸡蛋两个，把鸡蛋放在固定架上，锐端向上，以腆酒和酒精依次消毒蛋壳，用眼科手术刀在顶部穿一小孔，用三厘米长注射针头将被检血液徐徐注入卵黄中，每个鸡蛋接种血液0.2mL，立即用灭菌石蜡将孔密封，置37℃温箱中培养，五天后把接种血液的鸡蛋无菌打开用灭菌的毛细管把接种血液部分的卵黄及蛋清吸出 0.5-0.6mL, 接种2-3支斜面培养基上，置37℃培养，2-3天观察一次，15天仍不见可疑菌落生长，定为阴性。
A1.2 骨髓培养用灭菌的导尿管将尿液导出放入灭菌容器中，为浓缩细菌，提高检出率，可在尿液中加入1%-3%的高价布鲁氏菌免疫血清，混合后，置37℃温箱2h,高速离心沉淀，取沉淀物0.5mL接种在选择性培基上培养，或注射豚鼠，用生物学法分离布鲁氏菌。
A1.3 其他病原材料培养由乳、脑脊液、关节液和滑囊液分离布鲁氏菌，将液体标本无菌地接种到琼脂斜面上，或培养平板上，涂布于培基表面，参照血培养法观察结果，15天仍无可疑菌生长，定为阴性。
A1.4 生物学分离布鲁氏菌法为了提高对布鲁氏菌的检出率和从污染的材料中分离布鲁氏菌，将被检材料(固体标本加灭菌的生理盐水研碾成浆液态)经皮下或腹腔注射豚鼠或小白鼠，豚鼠接种1mL，小鼠接种 0.5mL，接种豚鼠，即可观察血清-变态反应情况，又可作细菌分离培养，小鼠感染后二十天解剖取脏器培养，豚鼠接种后三十天解剖取脏器培养。
布鲁氏菌病实验室诊断技术
布鲁氏菌病实验室诊断技术作者：王勤来源：《湖北畜牧兽医》2018年第04期摘要：对实验室常用的几种布鲁氏菌病检测方法进行了分析，为实验室检测不同动物群体选择相应的诊断方法提供参考。
关键词：实验室；布鲁氏菌病；检测方法中图分类号：S858 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）04-0025-01布鲁氏菌病（简称布病）是一种危害性极大的传染性人兽共患病，在世界范围内广泛流行。
其主要临床症状为雌性动物流产、生育力下降，雄性动物睾丸炎，甚至不育，给畜牧业造成严重的损失。
1 病原学方法从疑似感染布病的个体中提取血液或其他样本，对样本处理后在选择培养基上培养，如有菌落生长则通过细菌染色、生化试验等方法鉴别是否为布鲁氏菌，该方法准确性高，但危险性高、操作难度大、分离时间长，对试验环境要求严格，需在特定试验条件下进行。
2 PCR技术随着分子生物学技术的发展和普及，可通过 PCR、荧光定量PCR以及环介导等温扩增（LAMP）等技术对布病进行诊断。
其中PCR技术具有特异性高、灵敏度好、操作较简单等优点，可用于鉴别不同种属的布鲁氏菌。
荧光定量PCR 技术相较于传统 PCR 技术具有灵敏度高、高通量和方便快捷等优势，但由于其引物和探针设计较为困难，且限制较多，对专业技术有较高要求。
LAMP可用于对奶、组织等样本的检测，具有操作方便、可视性强、特异性高和试验条件要求低等优点，其灵敏性可达10 pg/反应，且可以在普通水浴下完成反应，适于基层检测使用。
但是LAMP存在多重扩增较为困难，样本污染等问题，且对引物设计要求很高限制了该技术的进一步使用。
3 血清学检测方法3.1 虎红平板凝集试验（RBPT）BRPT是在平板上将30 μL抗原与30 μL血清样品混合，4 min内观察是否出现凝集来判定阴阳性，该法使用方便、结果判定简单、价格低廉，适用于各种家畜布病的田间筛选，在国际上广泛应用，但是特异性较差，易出现假阳性。
家畜传染病学实验指导：布氏杆菌病的检疫
实验十一布氏杆菌病的检疫目的初步掌握布氏杆菌病的细菌学、血清学诊断及变态反应等检疫方法。
内容及方法家畜布氏杆菌病的检疫，即通过流行病学调查、临诊检查、细菌学检查、血清学诊断及变态反应等方法，检出畜群中的患畜。
实验诊断的材料可采取胎儿、胎衣、阴道分泌物、乳汁、血液、血清、动物尸体以及马的脓肿中脓汁等。
一、细菌学检查(一)染色检查病料以绒毛叶渗出液、胎儿的胃内容物及肺脏、阴道分泌物及脓肿中的脓汁，以及培养物等制成抹片，除用革兰氏染色法染色外，应用鉴别染色法进行显微镜检查。
布氏杆菌为球杆菌，0．5～0．7／lmX0．6一1．5pm，无鞭毛，不产生芽胞，不呈两极浓染，病料抹片呈密集菌丛，成对或单个排列，短链较少，革兰氏染色阴性。
它虽然不是抗酸性细菌，但可以抵抗脱色用的弱酸，例如0．5％乙酸。
这种特性结合布氏杆菌鉴别染色技术用于诊断有一定实际意义。
下面将列出两种较常用方法。
1．改良Ziehl-Neelsen氏法适于作胎膜和流产胎儿内容物染色之用。
流产数日内取阴道拭子制作抹片，也可用此法染色。
（1）抹片晾干，在火焰上固定。
(2)用Ziehl—Neelsen氏石炭酸复红原液的1：10稀释液染10～15min(原液为碱性复红1g，溶于10ml无水乙醇中，加入5％石炭酸溶液90m1)。
(3)水洗后，用0．5％乙酸脱色15～30s。
(4)充分水洗后，用1％美蓝复染20～60s。
(5)水洗、干燥、镜检。
布氏杆菌染成红色，背景为蓝色。
在胎膜抹片中经常看到布氏杆菌在染成蓝色的组织细胞中集结成团。
此法对诊断绵羊地方流行性流产，胎儿弯杆菌及其他传染病也有价值。
用此法染色时，胎儿弯杆菌和衣原体也染成红色，但可以从形态上区别。
2．改良Koster氏法(1)抹片自然干燥，用火焰固定。
(2)用新配制的番红(Safranin)和氢氧化钾混合液(番红饱和水溶液2份与lmol氢氧化钾5份混合)染lmin。
(3)水洗后，用0．1％硫酸脱色10s(或在10—20s内用0．1％硫酸处理两次)。
布病防治工作中检测制剂和技术的新动向
布病防治工作中检测制剂和技术的新动向【摘要】布病是一种由布氏杆菌引发的传染病，对人类和动物健康造成威胁。
布病的准确检测是预防和控制该病的关键。
目前现有的检测制剂和技术存在一定的局限性，需要不断改进和更新。
近年来，基因检测技术在布病检测中的应用取得了重要进展，为快速、准确地诊断提供了新途径。
新型免疫学检测技术、纳米技术、大数据分析以及仿生学技术也逐渐应用于布病的检测和防控工作中。
未来，布病防治工作中检测制剂和技术有望不断更新，提高检测的准确性和效率，为布病的防控工作提供更加有力的支持。
未来的研究方向应该集中在技术创新和多参数综合诊断上，以进一步提高布病检测的精准性和实用性。
【关键词】关键词：布病、防治、检测制剂、技术、基因检测、免疫学检测、纳米技术、大数据分析、仿生学技术、发展前景、研究方向1. 引言1.1 布病防治工作中检测制剂和技术的重要性布病是一种由布鲁氏菌引起的传染病，对人类和动物健康造成严重威胁。
在布病的预防和控制工作中，检测制剂和技术发挥着至关重要的作用。
通过及时、准确地检测布鲁氏菌的存在，可以帮助医疗机构快速诊断病例、隔离患者、采取有效的治疗措施，从而有效遏制疫情蔓延。
检测制剂和技术是预防布病的第一道防线。
通过对患者、患畜和潜在感染源的筛查，可以及早发现病例、追踪疫情，并及时采取控制措施，避免疫情扩散。
检测制剂和技术是确诊布病的重要手段。
准确的检测结果可以为医生提供重要参考，帮助确定患者是否感染了布鲁氏菌，指导后续治疗方案的制定。
检测制剂和技术还可以用于评估防控效果。
通过监测检测结果的变化，可以及时调整防控策略，提高工作效率和效果。
检测制剂和技术在布病防治工作中起着不可替代的重要作用，其准确性和及时性直接影响到疫情控制的效果。
不断提高检测制剂和技术的水平，引进新的技术手段，对于布病防治工作具有重要意义。
1.2 现有检测制剂和技术的局限性现有检测制剂和技术在布病防治工作中虽然起到了一定的作用，但是也存在着一些局限性。
布鲁氏菌病检测技术
布鲁氏菌病检测技术布鲁氏菌病检测技术1.概况布鲁氏菌病(简称布病)，是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患的传染病。
临床主要特征是母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织(如睾丸、关节)的炎症。
人类感染布病后，病程长，反复发作，长期不愈。
布病几乎遍及世界各地。
凡有牲畜的地区都有布病流行。
据不完全统计，在160个国家和地区中就有123个国家和地区有布病发生。
我国多见于内蒙古、东北，西北等牧区。
在北方农区也有散发，常呈地地方性流行。
在不良环境，如抗生素的影响下，本菌易发生变异，通常变异形成的布鲁氏菌可在机体内长期存在。
该菌对热抵抗力不强，63℃经7～10 min可被杀死，在鲜乳中可存活2天到18个月，在冻肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎儿体内可分别存活37天和6个月。
对常用消毒药敏感，如0.1％升汞数分钟，1％来苏儿或2％福尔马林15 min可将其杀死。
日光下曝晒4 h 可杀死本菌。
人和多种动物对布鲁氏菌易感。
动物中羊、牛、猪的易感性最强。
母畜比公畜，成年畜比幼年畜发病多。
在母畜中，第一次妊娠母畜发病较多。
带菌动物，尤其是病畜、流产胎儿、胎衣是主要传染源。
消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途径，也可通过损伤的皮肤、粘膜等感染。
常呈地方性流行。
人主要通过皮肤、粘膜和呼吸道感染。
本病一年四季均可发病。
流行区在发病高峰季节(春末夏初)可呈点状暴发流行。
患病与职业有密切关系，如：兽医、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工等感染机会较高。
人类布鲁氏菌病的预防，首先要注意职业性感染，凡在动物养殖区、屠宰区、畜产品加工厂的工作者以及兽医、实验室工作人员等，必须严守防护制度(即穿着防护服装，做好消毒工作)，尤其在仔畜大批生产季节。
更要特别注意。
病畜乳肉食品必须灭菌后食用。
必要时可用疫苗接种，接种前应行变态反应试验。
阴性反应者才能接种。
2.实验室监测技术概述(据布鲁氏菌病防治技术规范)2.1检测方法血清学实验或细菌分离。
初筛试验选用虎红平板凝集试验(RBPT)或乳牛布病全乳环状试验(MRT)(见GB/T 18646)。
布鲁氏菌病检测技术
样品处理方法与注意事项
处理方法
包括样品的保存、运输、分离和培养 等步骤，应严格按照操作规程进行， 以确保检测结果的准确性。
注意事项
在处理过程中，应注意防止样品的污 染和变质，避免影响检测结果。同时 ，还应注意个人防护，防止交叉感染 。
避免交叉污染和误操作措施
80%
严格分区操作
在样品处理过程中，应设置清洁 区、半污染区和污染区，并严格 分区操作，以避免交叉污染。
危害程度
布鲁氏菌病不仅危害人类健康，还影响畜牧业的发展，造成 严重的经济损失。同时，该病也是一种潜在的生物恐怖袭击 的病原体，对国家安全具有威胁。
流行病学特点及分布
流行病学特点
布鲁氏菌病在流行病学上表现为散发性和地方性流行，与家畜的饲养和畜产品 加工密切相关。人群对布鲁氏菌普遍易感，青壮年男性由于职业关系，其发病 率高于女性。
08
总结回顾与未来发展趋势
本次项目成果总结
成功研发出高灵敏度的布鲁氏菌病检测方法
通过优化反应条件和引物设计，提高了检测方法的灵敏度和特异性，为布鲁氏菌病的早 期诊断和治疗提供了有力支持。
建立了完善的布鲁氏菌病检测流程
从样本采集、处理到检测结果的解读和报告，建立了一套完善的检测流程，确保了检测 结果的准确性和可靠性。
03
专业技术人员不足
布鲁氏菌病检测需要专业的技术人员 进行操作和解读，但目前相关领域的 专业技术人员仍显不足，需要加强人 才培养和引进。
未来发展趋势预测
检测技术将更加智 能化和自动化
随着科技的不断发展，未来布 鲁氏菌病检测技术将更加智能 化和自动化，提高检测效率和 准确性。
多技术联合应用将 成为趋势
暗视野显微镜
利用特殊的光学原理，在暗背 景下观察发亮的细菌，提高检 测灵敏度。
布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析
布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析高明春1,2，王君伟 1,2（1.东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学教研室，哈尔滨 150030；2.国家奶牛产业技术体系疾病控制功能室，北京 100193）摘 要：布鲁氏菌病严重阻碍我国养牛业的健康发展，控制乃至根除布病是世界范围内各布病负担国的共识。
本文就各种布鲁氏菌病实验室诊断技术及其在布病净化程序中的适用性加以客观评述，谨供布病防控工作者参考。
关键词：布鲁氏菌病；实验室诊断技术；奶牛；肉牛布鲁氏菌病（布病）是一种公认的人畜共患传染病，人、畜布病均归因于6个陆生动物布鲁氏菌经典种中的5个种所致的感染，即人间布病全部源于动物布病，并且各国的研究表明消灭动物布病能够有效地从根本上减少人间布病。
近年，我国家畜布鲁氏菌病（布病）与人间布病暴发频繁，给畜牧业与人民健康带来了巨大损失，而控制及消除布病影响的一个前提是能够对布病动物进行有效的诊断。
国内外对布病系统性的研究有近150年的历史，期间开发了许多布病体外和体内诊断方法，这些诊断方法服务于不同的应用目的，例如：证实疫情发生、全国性普查、确诊、国际贸易检测以及“无布病”地区的布病监测等等，如何选择诊断策略取决于布病的流行状况及检测的目的[1～5]。
本文对新近探讨各种布病诊断方法的文献进行回顾，并评价其在净化程序中的适用性。
1 布鲁氏菌病概述布鲁氏菌病主要通过消化道、呼吸道、生殖道传播，也可通过损伤的皮肤、黏膜等感染，造成以生殖系统为主的多器官损伤。
牛群中暴发布病会导致大量怀孕母牛流产和奶产量降低，如发生流行，则会严重影响整个产业链。
布病还是公认危害最为严重的人畜共患病之一，人感染后反复发作，难以根治。
因此，世界上绝大多数“布病国家”积极开展了本国的布病根除计划，并且北美、中欧的几个国家及加拿大、日本、澳大利亚和新西兰等已确认根除了布病，取得“无布病国家”称号[6-8]。
布病最重要的临床表现是患畜在第一次怀孕期间流产，虽然通常怀孕母畜只流产一次，但在这些动物的生命周期中依然会保持感染状态。
布病检测工作实施方案
布病检测工作实施方案一、背景。
布病是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病，对人畜健康造成严重威胁。
及时、准确地进行布病检测工作对于预防和控制疾病的传播至关重要。
因此，制定科学合理的布病检测工作实施方案对于保护人畜健康具有重要意义。
二、检测目标。
1. 确定疫情情况，通过对人畜进行检测，了解疫情的分布和传播情况，为疫情防控提供科学依据。
2. 保障食品安全，对从事畜牧业和相关行业的人员进行定期检测，确保食品安全，防止疾病通过食品传播。
3. 防止疫情扩散，及时发现病例，采取隔离措施，防止疾病扩散。
三、检测方法。
1. 人员检测，定期对从事畜牧业和相关行业的人员进行血清学检测，及时发现感染者。
2. 动物检测，对家畜、野生动物等进行血清学检测，发现携带病原体的动物，及时隔离治疗或淘汰。
3. 食品检测，对从事食品加工和销售的人员进行检测，确保食品安全。
四、检测流程。
1. 采样，对需要检测的人员、动物和食品进行采样，确保样本的准确性和代表性。
2. 检测，使用血清学检测方法进行样本检测，确保检测结果的准确性和可靠性。
3. 结果分析，对检测结果进行分析，及时发现感染者和携带者。
4. 处理措施，根据检测结果，采取相应的处理措施，如隔离治疗、淘汰携带者等。
五、检测管理。
1. 建立档案，对参与检测的人员、动物和食品建立档案，做好信息管理工作。
2. 设立检测点，在重点地区设立检测点，方便对人员、动物和食品进行检测。
3. 宣传教育，加强对人员、动物饲养者和相关行业从业人员的宣传教育工作，增强其对布病检测工作的重视和配合度。
六、检测评估。
1. 定期评估，对布病检测工作进行定期评估，发现问题及时纠正。
2. 数据分析，对检测数据进行分析，了解疫情的变化趋势，为下一步防控工作提供科学依据。
七、总结。
布病检测工作实施方案的制定对于预防和控制疾病的传播具有重要意义，需要全社会的共同努力和配合。
只有通过科学合理的检测方法和完善的管理措施，才能有效预防和控制布病的传播，保障人畜健康。
布鲁氏菌的血清学检测方法
布鲁氏菌的血清学检测方法布鲁氏菌病（简称布病）是一种人兽共患的传染病，世界范围内流行。
布病给人造成了大量损失和痛苦。
近年由于布病的散发病例的增多，患者多无明确接触史，临床症状又不典型，因此其实验室检测至关重要。
目前布氏菌的实验室检测主要分三类：布氏菌细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测。
细菌学检测周期长、阳性率低、感染风险高等特点，分子生物学对仪器、人员、技术的要求较高使得这两类技术在临床诊断应用上不是很普遍，应用最多的还是布氏菌的血清学检测。
本文现就布氏菌的血清学的检测进行如下综述。
布氏菌血清学方法可以分为：凝集法、补体结合法、酶联免疫吸附试验法、荧光偏振法、胶体金层析法等。
其中凝集法是通过特异性抗体与颗粒性抗原结合产生凝集的血清学实验，现应用最多的为虎红平板凝集实验、试管凝集实验、二巯基乙醇试管凝集实验、抗人球蛋白抗体实验等。
虎红平板凝集实验（RBPA）其抗原系用抗原性良好的牛种布氏菌株在适宜培养基上培养收获菌体, 经加热灭活, 离心后用虎红染料染色, 悬浮于乳酸缓冲液（PH3.6-3.7）制成。
它能抑制非特异性反应的IgM和增强特异性IgG 的活性, 其反应敏感稳定, 特异性优于试管凝集实验。
因此PBPA在很多国家推广使用, 是我国常规的诊断方法之一。
RBPA操作简单，不需要大型精密的仪器，适合基层医疗机构和检测点应用。
因有很高的灵敏性且能在短时间内完成，RBPA常用于初筛实验。
其有很高的准确性，特别是当检测1:4稀释血清标本阳性时其诊断的特异性更高【1】。
但RBPA也有局限性，纤维蛋白原可与虎红染料发生非特异性结合形成假阳性【2】，急性病人早期，体内产生的抗体以IgM为主，RBPA可能检测为阴性。
试管凝集实验(SAT)又称莱特试验是1897年由Wright发明，其方法简便，特异性强，可半定量检布鲁氏菌抗体滴度，因此有很高的诊断价值，至今在临床上广泛使用。
我国布病诊断标准中当SAT滴度≥1：100可确诊是活动性布病。
牛羊布病的检测技术
牛羊布病平板凝集试验一、试验原理：该试验又称为板式孟加拉红平板凝集试验，由于所用的抗原是酸性（PH3.6--3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgMl类抗体的凝集活性，检查出的抗体是IgG类，因此提高了该项反应的特异性。
血清的制备一、血清制备将血液采集与无抗凝的离心管中，温室静置30分钟，3000r/min l离心5--10min,吸出血清（切勿吸出红细胞成分），分装备用。
要保存的血清则分离后装入离心管与-- 2 0 ℃的冰箱内保存。
二、虎平平板凝集试验（RBPT）将玻璃板清洗干净，划成50个方格（横10x纵5），每格4cm X 4 c m.每一格下再划1cm宽的小格，各格标上被检血清号，每一横行做两份待检血清。
在各方格中加入相应的被检血清 3 0 ul,,然后再其旁加入30ul虎红平板凝集抗原，用牙签搅动被检血清和抗原使之均匀混合，形成直径约2cm的液区。
轻微摇动，置室温条件下（2 0 ℃），4min内观察结果，同时设阳性血清和阳性血清对照。
方法二、在载玻片上加抗原30UL，加入30UL被检测血清，混匀。
在5min内观察结果，轻摇载玻片，出现凝集颗粒为阳性，否则为阴性。
三、结果观察当阴性血清对照不出现凝集（—），阳性血清对照出现凝集（+），方可对代检血清进行判定。
待检血清在4min,内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（—）四、注意RBPT 操作简单、反应迅速，且对试验条件要求不高，但特异性不高，易受试验温度和凝集时间等因素的影响，不易准确判定结果。
应用此法所得的阳性检出率为70%，较SAT(试管凝集试验) ELISA（酶联免疫吸附试验）低。
该方法主要用于初筛，对其阳性者，还必须经SAT检测为阳性后才能最终判定为阳性。
血清学技术在布鲁氏菌病诊断上的应用研究现状及评价
血清学技术在布鲁氏菌病诊断上的应用研究现状及评价布鲁氏菌病（以下简称“布病”）是布鲁氏菌属细菌引起的能在人和动物之间相互传染的疾病，这种疾病病程较长，病情反复，广泛分布于世界各个场所。
家畜染上布病不仅会对畜牧业带来一定的危害，而且严重威胁人类的健康。
目前医学上对此病的诊断主要依靠血清学技术。
本文将对血清学技术在布病诊断上的应用研究现状及评价进行研究。
标签：布鲁氏菌病；血清学技术；现状1.凝集实验（1）试管凝集实验（SAT）。
试管凝集实验可以在早期对发生在人类和动物身上的布病进行诊断，并且可以检测出人类和动物感染布病获得免疫后身体出现的血清抗体。
SAT具有稳定性和特异性，主要检测人和动物体内的IgG2和IgM 型抗体，其中检测IgM的敏感程度大于IgG2。
如果单一使用，会造成结果的假阳性或假阴性。
（2）平板凝集实验（PAT）。
PAT也是布病常规的血清学诊断方式，可以对布病进行普查，实验过程简易方便，敏感程度高于SAT，但有的情况下会发生非特异性凝集。
（3）虎红平板凝集实验（RBPT）。
RBPT可抑制非特异性反应的IgM与IgG 的活化，实验成本不高，适用布病的大范围检疫；不足之处是不能鉴定布病的发生是人工免疫还是自然感染的结果。
（4）乳胶凝集实验（LAT）。
采用改良后的LAT诊断布病存在95%的阳性率，和SAT与PAT比较，符合程度较高，适合在基层应用和推广。
（5）间接血凝反应（IHAT）。
在用凝集反应、补体参与反应和沉淀反应不能检测出布氏菌抗体的情况下，IHAT可以检测出微量的布氏菌抗体，从而诊断出布病。
不足的是IHAT抗原的制备比较复杂。
（6）抗球蛋白实验（AGT）。
AGT可检测人和动物体内的IgG、IgM和IgA 型抗体，可应用于布病的初期诊断，对慢性期布病的诊断价值更明显。
2.沉淀实验应用于诊断布病的沉淀实验有环状沉淀实验（RPT）、絮状沉淀实验（FPT）和琼脂扩散实验（GDT），其中GDT应用比较广泛。
牛羊布病诊断技术要点及防控
Veterinary clinical science | 兽医临床科学44 ·2020.240 引言布病全称为布鲁氏杆菌病，其病原为布鲁氏菌，该病传染性强，危害性大，传播速度快，是影响畜牧业发展及人类健康的乙类传染病，养殖场户要密切关注。
1 发病机理布病病原为布鲁氏菌，病原菌主要寄生于牛羊体内，然后通过粪便、尿液、乳汁等方式排出体外，会给周边环境、饲料及饮水造成污染，健康牛羊在接触后，会导致感染发病，部分病牛羊是由于吸血类昆虫传播导致患病。
2 流行病学布病以侵害牛羊的生殖系统和淋巴系统为主，对于外界环境有着较强的抵抗力。
该病可发生于任何年龄、品种及性别的牛羊，尤其是性成熟的牛羊，有发病率高于幼龄牛羊，母牛羊发病率高于公牛羊，公牛羊发病情况下，大多呈带菌和隐性感染状态。
该病的主要传染源是患病牛羊和带菌牛羊，健康牛羊直接接触患病、带菌牛羊后即可感染，或接触被污染的饲料、饮水后亦可被感染。
布病属于人畜共患病，在牛羊养殖中，如果自我防护不到位，接触患病牛羊的分泌物、排泄物后，可通过消化道、呼吸道等方式感染发病。
牛羊布病大规模爆发，主要来源于引种交易，呈地方性流行趋势。
牛羊布病可发生于一年四季，尤其是在春夏季节，是该病高发期，因此养殖场户要密切留意[1]。
3 诊断技术要点3.1 临床症状健康牛羊感染布病后，典型症状为流产，尤其是在牛羊怀孕3个月左右，流产几率较高，流产前母牛羊精神状态不佳，食欲下降，坐立不安，阴道部位流出一些污秽物，并伴有子宫内膜炎。
患病牛羊出现关节炎、乳腺炎等症状。
公牛羊患病的情况下，会出现坏死性睾丸炎及附睾炎。
3.2 剖检变化通过对病死牛羊尸体进行解剖可以发现，其胎盘绒毛膜下组织呈糜烂状态，伴有出血现象，胎衣明显增厚。
幼龄牛羊患病情况下，皮下和肌肉呈出血浸润现象，胃内残留大量黏液絮状物质，颜色为淡黄色，淋巴结肿大，肝脏肿大，脾脏肿大。
成年公牛羊患病情况下，可以发现坏死性睾丸炎及附睾炎，前期睾丸出现肿大，后期睾丸缩小。
布鲁氏菌病检测技术
布鲁氏菌病检测技术布鲁氏菌病检测技术1.概况布鲁氏菌病(简称布病)，是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患的传染病。
临床主要特征是母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织(如睾丸、关节)的炎症。
人类感染布病后，病程长，反复发作，长期不愈。
布病几乎遍及世界各地。
凡有牲畜的地区都有布病流行。
据不完全统计，在160个国家和地区中就有123个国家和地区有布病发生。
我国多见于内蒙古、东北，西北等牧区。
在北方农区也有散发，常呈地地方性流行。
在不良环境，如抗生素的影响下，本菌易发生变异，通常变异形成的布鲁氏菌可在机体内长期存在。
该菌对热抵抗力不强，63℃经7～10 min可被杀死，在鲜乳中可存活2天到18个月，在冻肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎儿体内可分别存活37天和6个月。
对常用消毒药敏感，如0.1％升汞数分钟，1％来苏儿或2％福尔马林15 min可将其杀死。
日光下曝晒4 h 可杀死本菌。
人和多种动物对布鲁氏菌易感。
动物中羊、牛、猪的易感性最强。
母畜比公畜，成年畜比幼年畜发病多。
在母畜中，第一次妊娠母畜发病较多。
带菌动物，尤其是病畜、流产胎儿、胎衣是主要传染源。
消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途径，也可通过损伤的皮肤、粘膜等感染。
常呈地方性流行。
人主要通过皮肤、粘膜和呼吸道感染。
本病一年四季均可发病。
流行区在发病高峰季节(春末夏初)可呈点状暴发流行。
患病与职业有密切关系，如：兽医、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工等感染机会较高。
人类布鲁氏菌病的预防，首先要注意职业性感染，凡在动物养殖区、屠宰区、畜产品加工厂的工作者以及兽医、实验室工作人员等，必须严守防护制度(即穿着防护服装，做好消毒工作)，尤其在仔畜大批生产季节。
更要特别注意。
病畜乳肉食品必须灭菌后食用。
必要时可用疫苗接种，接种前应行变态反应试验。
阴性反应者才能接种。
2.实验室监测技术概述(据布鲁氏菌病防治技术规范)2.1检测方法血清学实验或细菌分离。
初筛试验选用虎红平板凝集试验(RBPT)或乳牛布病全乳环状试验(MRT)(见GB/T 18646)。
布病检测方法及质量控制
（1）实验要点：
① 要严格控制孵育时间和实验温度。
② 洗涤步骤是最为关键的。要充分洗涤，拍干残留
液体，不要让板子变干燥。
③ 奶样要-20°C 冻存，在4°C 保存抗体滴度会降
低。
④ 实验过程中，要加入阴阳性对照。
（2）新进iELISA试剂盒的质控：
① 对不同检测样品都要进行一次质控（血清，奶）包
的布氏菌抗原发生特 异性结合，在电解质 的作用下，就会形成 肉眼可见的凝集反应， 通过这种检测来判断， 该动物是否为患病动 物。
优点：
① SAT主要检查血清中的IgG和IgM。 ② 特异较好，实用性、敏感性较强。
缺点：
① 有前带现象，有时出现假阴性结果。 ② 出结果慢，需要两天。
实验要点：
① 受检血清应新鲜、无溶血、无污染。 ② 存放血清处温度不能超过10℃，采血后应于3-4
（二）实验室诊断
实验诊断主要是运用实验技术和方法，通过感官、 试剂反应、仪器分析和动物实验等手段进行的诊断。 布病的实验室诊断包括病原学，血清学诊断。
1
病原学诊断
（1）病原分离鉴定 将病料中（组织或奶样）的病原进行分离培 养，并对其属、种、型进行分析。从而判定该 疑似病原是否属于布鲁氏菌属，属于布鲁氏菌 属的那个种（流产，猪，羊等），属于该种布 鲁氏菌的哪个变型。
通过以上标准对抗原进行质控至关重要。因为如
果没有良好质控的话，则实验中虎红抗原可能会过 于敏感（产生许多假阳性），或敏感性不够（产生 许多假阴性）。
当没有OIE标准血清时，需要使用国家标准血清
对抗原进行质控。国家标准血清符合OIE的要求， 应由国家参考实验室提供。
2.2 SAT
• 特异性抗体可与相应
布鲁菌病实验室检测
采集后应尽快将样本送 往实验室进行检测，避 免延误诊断和治疗。
实验室检测人员应具备 相关专业知识和技能， 按照标准操作程序进行 检测，确保结果准确可 靠。
04
实验室检测操作步骤及注意事项
试剂准备与仪器校准
准备所需试剂
包括培养基、生化鉴定试剂、染色液等，确保试剂在有效期内且储存条件符合要 求。
仪器校准
临床表现与危害
临床表现
发热、多汗、乏力、关节炎、睾丸炎 、淋巴结及肝脾肿大等
危害
影响劳动力和人口素质，如果治疗不 及时，容易由急性转变为慢性，反复 发作，迁延数年，严重影响劳动能力 ，甚至病灶纤维化
流行病学特点
地区分布 全世界范围分布，我国多见于内蒙、东北、西北等牧区 人群分布 与职业有密切关系，兽医、畜牧者、屠宰工人等人群发病率高 时间分布 一年四季均可发病，但以春夏之际发病居多
质量管理体系文件
编制实验室质量管理体系文件，包 括质量手册、程序文件、作业指导 书等，以规范实验室的工作流程。
关键环节质量控制措施
01
02
03
04
样品接收与保管
建立样品接收、登记、标识、 保管等流程，确保样品的完整 性和可追溯性。
仪器设备管理
检测方法与标准
对实验室的仪器设备进行定期 检定/校准、维护保养，确保其 处于良好的工作状态。
利用特异性引物扩增布鲁氏菌的DNA片段，通过电泳等方法观察扩增
结果，检测样本中布鲁氏菌的存在。
02
实时荧光定量PCR（qPCR）
在PCR反应中加入荧光探针，实时监测荧光信号的变化，定量检测样本
中布鲁氏菌的DNA含量。
03
基因芯片技术
将大量布鲁氏菌特异性基因探针固定于芯片上，加入患者样本进行杂交
猪布鲁氏茵病的诊断及快速检测技术
猪布鲁氏茵病的诊断及快速检测技术作者：曾永强来源：《畜牧兽医科学》 2017年第5期布鲁氏菌病简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病。
可感染猪、牛、羊、犬、猫、鸡、鸭等多种动物，但猪、牛、羊最易感，其中感染猪的称为猪布鲁氏菌。
长期以来，布鲁氏茵病在牧区的感染率较高，因此常规监测多在牛、羊当中进行，但近年来，猪感染布鲁氏菌病的比例有所上升，给养猪户造成了一定的经济损失，同时，对养猪户的身体健康来说也是潜在威胁。
布鲁氏菌可侵害人的运动、神经、呼吸、消化、泌尿生殖等多个系统，感染者出现多部位疼痛、关节炎、肺炎、肾炎、不孕不育等，病程长，难以治愈，愈后也易复发，对人体健康而言是长期的危害。
1猪布鲁氏菌病的流行病学特征本病多发生在配种、产子季节，呈地方流行性，猪主要经消化道、呼吸道、生殖道及破损皮肤感染布鲁氏菌病，患病猪是主要的传染源，患病猪的粪便、尿液、乳汁、生殖道分泌物等都能带菌，但病菌对外环境的抵抗力并不强，常规消毒药对其都有消毒灭菌的效果。
2猪布鲁氏菌病临床诊断要点不同品种、不同年龄段的猪对布鲁氏菌病都易感，但仔猪多数不出现临床症状，呈隐性感染。
怀孕母猪和生殖期的公猪临床症状最明显，怀孕母猪主要表现为流产，多发生在怀孕的前3个月内，胎儿出现自溶、水肿，流产前母猪会出现食欲不振，坐卧不安，乳房肿胀，阴道分泌物增多，若流产出现在怀孕早期则不易被饲养员发现，流产后母猪易发生胎盘炎、子宫内膜炎等。
生殖期的公猪主要表现为睾丸炎和附睾炎，性欲降低，不愿配种，部分公猪出现关节炎，后肢麻痹等。
在猪布鲁氏菌病的临床诊断当中，其主要临床症状在很多猪病当中具有普遍性，特征单一，因此，临床症状只能作为辨别此病的参考，如果怀疑是猪布鲁氏菌病时，可使用布鲁氏菌快速检测卡进行检测，可在短时间内得到准确判断。
3猪布鲁氏菌病快速检测技术笔者所在地区所采用的猪布鲁氏菌病快速检测技术，是使用布鲁氏菌病抗体快速检测卡进行检测，取全血或血清样品，用胶体金法进行标记，如果检测卡只显示C对照线，说明该样品中布鲁氏茵病抗体呈阳性，即该样品对应的猪已感染布鲁氏菌病；如果检测卡显示出C对照线和rI检测线，说明该样品中布鲁氏菌病抗体呈阴性，即该样品对应的猪没有感染布鲁氏菌病。
布病检验
试管凝集试验
评价：
• 该方法简便、易操作，适用于各实验室应用 • 该方法特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临
床诊断 • 有材料报道，人感染布氏菌后常于发烧的第一天起就开
始出现抗体，随着体温的增高效价升高，因此该方法可 做为早期诊断布氏菌病的方法，也可做为判定疾病的活 动期 • 该方法凝集反应的强度与布氏菌培养的阳性结果成正比 ，凝集价越高细菌培养的阳性就越高，和发烧呈正比， 一般来说，体温高凝集价也增高 • 由于该试验有时出现前带现象和封闭现象，所以有时也 出现假阴性结果，必要时和其它方法联合应用
实验室检查
病原学检查：病原的分离是确 诊布病最可靠的方法
病原学检查包括布氏菌的分离 培养（血培养、骨髓培养）、鉴定
特异性血清学诊断技术
• 平板凝集试验 • 虎红平板凝集试验 • 试管凝集试验 • 补体结合试验 • 抗球蛋白试验 • 含巯基化合物处理血清后凝集试验
虎红平板凝集试验
虎红平板凝集试验(RBPT)中所用的抗原是 酸化性（PH=3.6~3.9）带色抗原，与被检血 清作用时能抑制血清中IgM类抗体凝集活性 检查出的抗体是IgG类。
试管凝集反应标准比浊管配制
管号 1 2 3 4 5
抗原稀释 液（ml）
0.00
生理盐水 （ml）
1.00
透明度 100%
0.25
0.75
75%
0.50
0.50
50%
0.75
0.25
25%
1.00
0.00
0%
标记
++++ +++ ++ ＋ －
1. “++++”液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗 粒状沉淀，呈100%凝集；
布病防治工作中检测制剂和技术的新动向
布病防治工作中检测制剂和技术的新动向1. 引言1.1 布病的危害布病是一种由布氏菌引起的传染病，主要通过感染的动物的体液和组织传播给人类，严重威胁着人类和动物的健康。
布病可引起发热、贫血、关节炎等症状，严重时还会导致内脏器官损害甚至死亡。
在农村地区和畜牧业发达地区，布病的发生率较高，给当地居民和畜牧业生产带来了巨大的危害。
由于布病的潜伏期较长，很容易被忽视和延误治疗，因此布病的防治工作显得尤为重要。
布病不仅对人类健康有着巨大的危害，同时也会直接影响畜牧业的发展和经济效益。
由于传统的布病检测方法复杂、耗时长、准确性不高，造成了布病检测工作的困难和不足。
开发新的检测制剂和技术，提高检测效率和准确性，对于布病的早期发现和有效防控具有重要意义。
通过引入先进的检测制剂和技术，可以提高对布病的监测和控制水平，降低疫情传播的风险，保障人类和动物的健康安全。
1.2 检测制剂和技术的重要性在布病防治工作中，检测制剂和技术的重要性不言而喻。
布病是一种由布氏杆菌引起的传染病，其危害性极大，不仅危害人类健康，还对家畜养殖业造成了严重影响。
及时准确地检测和诊断布病，对于控制疾病的传播、预防疾病的扩散具有至关重要的意义。
检测制剂和技术能够帮助及时诊断患病个体，从而采取相应的隔离和治疗措施，防止病情进一步恶化，避免疫情的扩散。
通过检测制剂和技术，可以对病原体进行迅速准确的检测和鉴定，为疫情防控提供科学依据，指导相关工作的开展。
随着科技的不断发展，新型的检测制剂和技术不断涌现，其具有快速、灵敏、高效的特点，能够更好地满足布病防治工作的需求，提高防控效率和水平。
加强对检测制剂和技术的研发和应用，不仅可以提高检测的准确性和敏感性，也可以为布病防治工作提供更有力的支持，促进我国布病防治工作向更高水平发展。
2. 正文2.1 当前布病检测制剂和技术的传统局限1. 传统的检测方法存在灵敏度和特异性不足的问题。
传统的血清学方法虽然在布病的诊断中具有一定的敏感性和特异性，但是在早期感染和潜伏期的检测中存在一定的局限性，容易导致漏诊或误诊的问题。
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4、血清在进行灭活处理时，温度过高会使血清中的少 量胶原蛋白出现凝固作用，使抗原与抗体无法充分结合， 影响结果判定。 5、氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐的 浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界为了克服 凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血清采用高渗盐水 作凝集反应，一般浓度在10~12%，切记人血清不能用高 渗盐水（> 10% ）。
影响试验结果的因素及注意事项： 1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温 度不能超过10℃，采血后应于3—4日内进行检查， 因放置时 间过长可能会导致血清效价降低。 2、遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂的 加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要按要 求，否则都影响结果。 3、血清或抗原中含有过多的防腐剂，阻止或妨碍了抗 原的凝集。
试管凝集实验的评价：
• 简便、易操作，适用于各实验室应用。 • 特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临床诊
断。 • 有材料报道，人感染布氏菌后常于发烧的第一天起就 开始出现抗体，随着体温的增高效价升高，因此该方 法可做为早期诊断布氏菌病的方法，也可做为判定疾 病的活动期。
• 试管凝集反应的强度与布氏菌培养的阳性结果成正比，
样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作抽取静脉血5ml、3000转/分离 心15min分离血清备检。 试剂及器材 试管凝集抗原、被检血清、阳性血清、稀释液（0.9% 生理盐水） ；1ml、 10ml 吸管、试管架、37 ℃温 箱、离心机等
抗原稀释
操作步骤
被检血清
SAT
标准比浊管 配置
阳性对照
操作步骤 在玻片上加0.04ml被检血清，然后加入虎红平板抗 原0.04ml，摇匀或用玻璃搅棒混匀，在5min内判定结 果。
质量控制 所用器材洁净，试剂标准，并在有效期内使用，所 加剂量必须准确。血清标本不得发生溶血 结果判定 在5min内出现可见的凝集现象为阳性反应无凝集 现象出现为阴性。 工作时限要求 个案病例，送检材料2日内完成，大批量样本不得 超过7日。如全血不能及时分离血清，可冷藏4°C保 存，但保存期不得超过3日。血清可冷冻保存，保存 期不得超过2月。
玉门市疾控中心
世卫组织建议的检测包括：
• 虎红平板试验(RBT) 血清凝集试验(SAT) Coomb`s试 验 补体结合试验(CFT) ELISA 荧光偏振 布氏菌 培养 PCR • 世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏 性和特异性） • 没有明确的阳性和阴性预测值（PPV & NPV） 结论 取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不 同，有待优化 PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立 建议 开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵 敏性、特异性、PPV和NPV等）
②标准阳性血清冻干品，使用前用蒸馏水溶解至 规定容积。 ③标准阴性血清:冻干品，使用前用蒸馏水溶解至 规定容积。 3、被检血清 ①按常规方法采血分离血清 血清必须新鲜，无 明显蛋白絮凝物、无溶血和无腐败气味。 ②运送和保存血清样品 防止血清冻结和受热， 以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，可用冷藏方 法运送血清。
出现前带现象的原因分析： 做凝集反应实验时，有个别血清会出现前带现象，比 喻为“本来是前面清亮，后面浑浊，而出现前面浑浊， 后面清亮现象”即稀释度低的血清管内（或血清量多的 管）不发生凝集，而稀释度高的管内（或血清量少的管） 出现凝集，这叫做前带现象。如果某血清在虎红平板凝 集反应中出现了前带现象，那么做试管凝集反应时应多 做几个管，多采用几个不同的稀释度进行判定。
1. 2.
3.
4. 5.
“++++”液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗 粒状沉淀，呈100%凝集； “+++” 液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，呈 75%凝集； “ ++ ” 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈 50%凝集； “+” 液体不透明，管底有不很明显的伞状沉淀， 呈25%凝集； “-” 液体不透明，无伞状沉淀。 [注]：效价：以产生 50%凝集的(++凝集程度)血清 最高稀释倍数为受检血清的效价。
试管凝集试验（SAT） 补体结合试验（CFT）
用于确诊。
滴度1：10 +及以上。
布鲁氏菌病抗-人免疫球蛋白试验（Coomb’s）
滴度1：400 +及以上。
原理：虎红平板凝集试验(RBPT)中所用的抗原是酸化性 （PH=3.6-3.9）带色抗原，与被检血清作用时能抑制 血清中IgM类抗体凝集活性，检查出的抗体是IgG类。 目的、对布病的诊断意义 排除某些非特异性凝集及某些其它细菌共同抗原与 抗布氏菌血清出现的交叉反应，是一种快速、简便而 有效的实验。该法多用于大规模筛选。
结果判定： 1 、人血清中滴度为 1 ： 50( ± ) 判定为可疑，滴度为 1:100（+）及以上滴度判定为阳性。 2、牛、马、鹿、骆驼等大型动物血清滴度为1：100(+) 及以上者判定为阳性，滴定为1：50(±)为可疑。 3 、猪、羊 ( 绵羊、山羊 ) 、犬等小家畜血清滴度为 1 ： 50(+)及以上者判定为阳性，滴定为1：25(±)判定为 可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查，复查 时主要结合流行病学和临床表现而定，流行病学不成 立者不必复查，复查主要目的是便于进一步确定诊断。
实验前的准备
1、试管的准备 ① 把试管浸泡于带有洗涤剂的温水中30分钟，浸泡后用 试管刷将其刷干净。先用自来水冲洗10遍，再用去离子水冲洗 1遍。 ② 试管冲洗干净后倒置于篮子中，等水沥干后置干燥箱 中，160℃干燥3个小时（整个干燥过程需要5~6个小时）。 ③ 实验前要配置0.5%的石炭酸生理盐水 配置方法： 称取0.5克石炭酸，加入100ml的生理盐水中，配置后置高压锅 中121℃高压30分钟。 2、试剂的准备 ①标准抗原:按照说明书使用。使用时充分摇匀，用稀释 液作1：20(工作浓度)稀释。
凝集滴定越高细菌培养的阳性就越高，同时与临床症 状中的发烧呈正比，一般来说，体温高凝集滴定也会 增高。 • 由于试管试验有时会出现前带现象和封闭现象，所以 有时也出现假阴性结果，必要时和其它检验方法及临 床表现相联合应用。
谢谢大家聆听！
优点：简便、快速、易掌握，敏感性较好；可作为 筛查试验；经济、方便。 注意事项： 1）观察结果在自然光状态下。 2）混合液体面积尽量大，使得抗原和 血清中抗体充分反应。
原理：SAT是一种特异、较敏感、稳定的检测方法，可 以检测人、畜血清中的抗布鲁氏菌IgG、IgM、IgA 3 类免疫球蛋白，且SAT检测IgM的敏感性较高，因此可 作为布鲁氏菌病的早期诊断，同时又可用于布鲁氏菌 病疫苗免疫后血清抗体的检测。 应用：试管凝集试验（SAT）的应用已有近百年历史， 国内外成功地应用到人、畜间布鲁氏菌病的诊断上。 实践证明该试验时一种简便异形，有一定特异性和敏 感性的布病诊断方法。SAT试验操作简便，判定容易， 因此有广阔的应用前景。 检测IgM的敏感性较高。（布病主要产生IgM、IgG 两种抗体）
样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作采取静脉血5ml置于无菌一 次性采血管内(不加任何抗凝剂的空管采血3-5ml)， 置斜面，分离血清。 所需试剂、仪器设备、试验环境条件 清洁脱脂玻片或凹形孔的玻片、1ml吸管或微量加 样器、微型玻璃搅棒（可用牙签替代）、虎红平板凝 集抗原、被检血清。
抗原的稀释：将试管凝集抗原充分混匀后， 用0.9%生 理盐水做10倍稀释，备用。 标准比浊管的制备：为了判定结果准确，应制备凝集反 应标准比浊管，作为判定透明程度的依据，其配制 方法如下：取凝集反应稀释后的抗原液再作对倍稀 释，即2ml稀释抗原再加2ml盐水，混合后按下表配 制。
管号 1 2 3 4 5 抗原稀释液 （ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 生理盐水（ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 透明度 100% 75% 50% 25% 0% 标记 ++++ +++ ++ + —
胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子多，它影 响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含胶体粒子少，所 以出现凝集。 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原， 所以在低稀释度的管中不凝集。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多 防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的 干扰。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多 防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的 干扰。
3、加入抗原：取出之前稀释好的试管凝集抗原，然后 从第二管开始每管加入0.5ml，加入抗原之后，血清 的最终稀释倍数为从第二管开始1：50、1：100、1： 200、1：400……1:1600，第一管为血清对照。然后 充分混匀，放于37℃温箱中18-20小时后取出，在室 温下放置1-2个小时观察结果。 阳性对照：加入1ml的生理盐水使其溶解（充分溶解 使阳性血清的效价发挥到最大），稀释、加入抗原 （方法、步骤同被检血清样本的操作）。
实验室检查方法
（一） 外周血象
白细胞计数正常或偏低。
淋巴细胞相对或绝对增加，可出现少数异型淋巴细胞。 血沉在急性期加快，慢性期则正常或偏高，持续增速
提示有活动性。
（二） 病原学检查
取血液、骨髓、组织、脑脊液等做细菌培养，急性期
培养阳性率高。
（三） 免疫板凝集试验（PAT）结果为阳性， 用于初筛。
被检血清： 1、每份血清取9支小试管，放于试管架上。 2、血清稀释：第一只管加生理盐水2.4ml，第二只不 加，第三只到第九只管各加0.5ml盐水。然后用1ml吸 管取被检血清0.1ml加入第一管中，混匀后吸1ml加入 第二、三管各0.5ml，第三管混匀后再吸0.5ml加入第 四管，以此类推到第八管吸0.5ml弃掉。